分割型AkaLucを用いたPPARγリガンドの生体内可視定量化技術の開発

2021 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 20K15450
• Research Institution: Toyama Prefectural University
• Principal Investigator: 真野 寛生 富山県立大学, 工学部, 研究員 (20787634)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: PPARγ / 核内受容体 / バイオセンサー / 分割型ルシフェラーゼ / イメージング

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、分割型AkaLucを用い、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（PPARγ）のリガンドを高感度に検出し可視化するバイオセンサーを構築するのが目的である。PPARγの合成リガンドは、糖尿病やアルツハイマー病をターゲットに研究が行われており、本バイオセンサーの開発に成功し実用化できれば、PPARγリガンドの体内動態・脳内移行を長期的に調べることが可能となり、医薬品の副作用の有無を評価するなど、医療面で大きく貢献できると考えられる。
2020年度は、NanoLuciferase (NLuc)の分割型であるNanoBiT技術を用い、PPARγのLBDと相互作用するLXXLL配列を網羅的にスクリーニングする事に注力した。その結果、PPARγのLBDと相互作用するLXXLL配列の候補をいくつか見出すことに成功した。
2021年度は、前年度に見出したLXXLL配列を基本骨格とし、遺伝子工学的手法を駆使して、 発光変化量や発光強度のより大きいものへの改良を施し、検出感度の高いバイオセンサーの構築に成功した。具体的には、バイオセンサー中への(GGGGS)リンカー配列の挿入、LXXLL配列の最適化、さらに、転写抑制因子中のLXXXIXXXL配列の選抜および挿入を行った。その結果、PPARγリガンドに応答して発光が約30倍増加するバイオセンサーの創出に成功した。
研究の最終目標はAkaLucの分割型を用いてPPARγリガンドを可視化するバイオセンサーの開発であったが、他の研究結果からもAkaLucの分割型は成功例がなく、本研究においても苦戦を強いられたため、研究期間内においては分割型AkaLucを断念し、NLucでの開発に路線変更した。
生体内での可視・定量化を想定した場合、AkaLucのほうが有利であるため、今後、問題点の解明および解決策を検討して進めていきたい。