2020 Fiscal Year Research-status Report
真の枝分かれ抑制ホルモンの同定を志向した典型的ストリゴラクトン生合成経路の解明
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20K15459
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| Research Institution | Kobe University |
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Principal Investigator |
若林 孝俊 神戸大学, 農学研究科, 助手 (20843858)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ストリゴラクトン / 根寄生植物 / 植物ホルモン / 生合成 / シトクロムP450 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ササゲおよびトマトのVuCYP722C、SlCYP722Cは、典型的SLのorobancholの生合成に関与する。CYP722Cサブファミリーは双子葉植物に広く保存されているため、この酵素が典型的SLに必須のBC環形成に関与していると考えられた。本年度は、orobancholとはC環の立体が異なるSLの5-deoxystrigol（5DS）を生産するワタのGaCYP722Cの機能解析を実施した。昆虫細胞発現系によりタンパク質を異種発現させ、それを用いたin vitro酵素アッセイを行った。その結果、GaCYP722Cがcarlactonoic acid（CLA）から5DSへの立体選択的な変換反応を触媒することを見出した。また、近年、ミヤコグサにおいて、5DSが欠損した5-deoxystrigol defective（DSD）変異体が報告され、その原因遺伝子はLjCYP722Cであった。これらのことから、CYP722Cは典型的SL生合成のための鍵酵素であると結論づけた。一方、ミヤコグサはCYP722Cを2コピー有している（DSD/LjCYP722C-1、LjCYP722C-2）ため、これら２つの酵素機能解析を行った。しかし、GaCYP722Cとは異なり、CLAから5DSへの選択的な変換反応は触媒しなかった。
また、単子葉植物におけるCYP722Bサブファミリーとして、イネおよびソルガムのOsCYP722B、SbCYP722Bの機能解析を行った。その結果、これら２つの酵素は、CLAを基質とした反応を触媒したが、典型的SLへの変換を触媒しなかった。
トマトにおけるSlCYP722Cノックアウト体（KO体）を用いた新規SLの探索については、KO体抽出物をLC-MS/MSで分析した結果、複数のSL関連化合物と思われるピークを検出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画に従って、CYP722ファミリーの機能解析を進めることができ、それらの酵素機能に関する知見が集積されつつある。さらに、初年度開始時には論文化されていなかった、ソルガムの典型的SL生合成に関わるsorgomol合成酵素について、国際学術誌にて報告した
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| Strategy for Future Research Activity |
2021年度も、初年度に引き続き、CYP722ファミリーの詳細な酵素機能解析を行う。ミヤコグサのLjCYP722C-1/DSDおよびLjCYP722C-2については、それぞれの遺伝子の変異体を利用し、生産されるSLプロファイルを解析することで、これらの酵素機能の理解を深める。
LjCYP722Cに加え、OsCYP722BおよびSbCYP722Bについては、ベンサミアナタバコを用いたアグロインフィルトレーション法による一過的タンパク質発現システムにより、その機能を検証する。すなわち、CLAを合成するためのSL生合成のコア経路に関与する、D27、CCD7、CCD8およびMAX1ホモログと、ターゲットであるCYP722C/CYP722Bを同時に発現させることで、タバコ葉内在のβ-カロテンを基質としてSLを合成させる。合成されたSLをLC-MS/MSを用いて分析し、標品と比較することで構造を決定あるいは推定し、CYP722C/CYP722Bの機能を調べる。
KO体を利用した新規枝分かれ抑制ホルモンの探索については、植物体の抽出物量を増やしLC-MS/MSで分析する。この際、SL特有のフラグメントイオンであるm/z 97を持つ化合物を探索する。KO体では典型的SLが欠損しているのも関わらず、枝分かれが増加しないため、非典型的SLが枝分かれ抑制ホルモンとして機能していると考えられる。まずはKO体と野生型のSLプロファイルを比較し、KO体で蓄積している化合物、あるいは共通して存在する化合物を探索する。検出されたSL関連化合物については、HPLCによる精製を試みる。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の感染防止のため、発表を予定していた国内外の学会がなくなったため、次年度使用額が生じた。次年度では主に消耗品の購入に使用する予定である。
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