2021 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of structure of plant proteoglycans and its involvement in freezing tolerance
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20K15494
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| Research Institution | Saitama University |
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Principal Investigator |
高橋 大輔 埼玉大学, 理工学研究科, 助教 (20784961)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | プロテオグリカン / 凍結耐性 / 植物 / 糖鎖 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物は凍結ストレスに適応するために、低温馴化と呼ばれる機構を備えている。低温馴化は凍らない程度の低温で誘導され、植物は低温馴化により様々な生理変化を経て凍結耐性を向上させる。本研究では、植物のプロテオグリカンであるアラビノガラクタンプロテイン（AGP）に着目して研究を行った。AGPは膜結合型、および遊離型として細胞壁と細胞膜の双方に局在することが知られている糖タンパク質であり、塩ストレスをはじめとした環境ストレスとも関連性が深いとされるタンパク質である。。本研究では、膜結合型、および遊離型AGPの糖鎖構造の違いと、低温馴化過程におけるAGPの発現量変化、および糖鎖構造の変化を明らかにすることを目的とした。
本年度は、ブロッコリースプラウトを可溶性タンパク質画分、細胞膜画分、細胞膜以外のミクロソーム画分に分画し、それぞれのAGPの糖鎖構造を特異的分解酵素とHPLCを用いて解析した。その結果、細胞膜で最も複雑な糖鎖構造が見られ、遊離型AGPでは細胞膜結合型AGPに比べて側鎖のL-アラビノース残基が末端に少ないことがわかった。また、細胞膜以外のミクロソーム画分に見られるAGPでは、主鎖と極めて単純な側鎖構造のみが検出されたため、合成途上のAGPの構造を解析することができたと考えられる。
また、シロイヌナズナゲノムがコードするAGP遺伝子のうち、ファシクリン様AGP（FLA）と呼ばれるグループの遺伝子発現量を定量的PCRにより解析し、FLA8に着目して欠損変異体の解析を行った。その結果、FLA8の欠損により低温馴化過程で凍結耐性が低下する傾向が見られた。また、FLA8は主に細胞壁に局在し、特に維管束組織で強く発現していることがわかった。
今後は、膜結合型、および遊離型AGPの糖鎖構造の低温馴化過程における糖鎖構造変化とFLA8の凍結耐性への寄与を中心に研究を進める。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、当初計画していたAGPのコアタンパク質のプロテオーム解析による同定は、脱グリコシル化が極めて困難と判断し、代わりにシロイヌナズナがコードするFLA遺伝子すべての遺伝子発現変化を解析した。この結果より、FLA8を低温馴化で最も顕著に発現するタンパク質と位置づけ、凍結耐性へのFLA8の寄与を見出しつつある。また、これらの組織特異的発現や細胞内局在解析などもGUSやGFPなどのレポーター遺伝子を用いた解析により進めることができた。本実験は2年目に計画されていたものであり、おおむね計画通りに進行していると考えられる。
また、AGPの糖鎖構造解析においては、ブロッコリースプラウトを用いた系により、合成途上から細胞膜に提示されて遊離するまでの一連のAGPの糖鎖構造の変化を推測することができた。この系をシロイヌナズナに応用すると共に、低温馴化前後での比較を行っていく。また、初年度の研究で、4-メチルグルクロン酸を含む側鎖が、遊離型AGPにおいてのみ低温馴化過程で増加しているという結果が得られたことから、これらの側鎖構造の合成や分解に関する遺伝子の発現解析も進めている。
上記実験の進捗を総合的に判断し、「おおむね順調に進展している」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
2022年度は、2021年度で得られた糖鎖構造解析の結果をさらに補強するための解析を行う。具体的には、従来のHPLCを用いた解析ではなく、ガスクロマトグラフィーによる糖鎖のリンケージ解析を行い、膜結合型および遊離型AGPの詳細な糖鎖構造の差異を明らかにする。また、低温馴化によるAGPの糖鎖構造変化の解析も、同様の方法で進める。これに合わせて、4-メチルグルクロン酸を含む側鎖が低温馴化過程でどのように変化するのか、そのメカニズムに迫るために関連遺伝子の発現解析を行う。
また、現在低温馴化関連AGPとして着目しているFLA8に関しては、GFPタグを用いたFLA8単一分子の糖鎖構造変化をウエスタンブロッティングにより示すことを試みている。また、FLA8の欠損変異体にFLA8遺伝子を導入した植物において、凍結耐性が野生型レベルまで回復するか検討を行う。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルスの感染拡大により、旅費等を支出することができなくなったため。2022年度は国際会議等の対面開催が予想されるため、それらの参加費として計上する予定である。
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