微細藻類における油脂「低」蓄積変異株の育種とそのメタボローム解析

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K15599
• Research Institution: Kobe University
• Principal Investigator: 加藤 悠一 神戸大学, 先端バイオ工学研究センター, 特命助教 (70791903)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 微細藻類 / クラミドモナス / 油脂 / バイオ燃料 / メタボローム解析

Outline of Annual Research Achievements

微細藻類は光合成により二酸化炭素を固定して油脂を多量に合成する。光合成的に生成する炭素源を油脂として蓄積するのではなく別の物質の合成に利用できれば、その生産性は飛躍的に向上すると思われる。それには油脂の合成不全を起こした油脂低蓄積変異株を宿主として利用する方法が考えられるが、そのような変異株はバイオ燃料生産者としての有用性が低いため、これまでに詳細な解析がなされていない。本研究では、油脂低蓄積変異株の利用可能性を検証し、この生産戦略の学術的基盤を構築するため、微細藻類クラミドモナスの油脂低蓄積変異株を育種し、油脂含有率低下の影響を代謝レベル・遺伝子レベルで解明する。
本年度は、油脂低蓄積変異株の作出に向けて、親株の選定と形質転換手法の確立に取り組んだ。本研究では、抗生物質耐性カセットをゲノム中のランダムな部位に挿入することで遺伝子破壊株のライブラリを用意する。エキソンに対しての耐性カセット挿入が望ましいため、遺伝子数やエキソン領域の割合を考慮して10^5種類以上の形質転換体を含むライブラリを作成することを目標としている。まずは一般的なクラミドモナス野生株を用いて耐性カセットの導入を実施したが、この目標に対しては形質転換効率が低いことがわかった。そこで、細胞壁欠損株を含む数種類のクラミドモナス候補株を新たに用意し、油脂含有率と形質転換効率の観点から親株の選定を実施した。また選定した親株においてエレクトロポレーション条件などの見直しを行い、目標とするサイズのライブラリを得るのに十分な形質転換効率を達成した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当初の計画では、一般的なクラミドモナス野生株を親株として遺伝子破壊株のライブラリを作成することを想定していた。しかし、野生株は細胞壁を有するためエレクトロポレーションによる形質転換効率が低く、目標とするサイズのライブラリ作成が難しいことがわかった。そこで親株を形質転換効率の高い細胞壁欠損株から再選定し、形質転換条件の検討を行なった。目標とするサイズの遺伝子破壊株ライブラリを作成可能な形質転換効率が達成できたことから、今後は本年度の遅れを取り戻すべく研究を遂行していく。

Strategy for Future Research Activity

選定した親株と確立した形質転換条件を用いて、遺伝子破壊株ライブラリを作成し、本年度に完了できなかった蛍光活性セルソーターによる油脂低蓄積変異株のスクリーニングを速やかに行う。獲得した油脂低蓄積変異株のシーケンス解析を行い、油脂低蓄積の原因となった変異遺伝子を解明する。解明した変異遺伝子がその配列情報から油脂合成のレギュレーターであると思われる場合には、RNA-seq解析を実施して遺伝子発現量の変化を網羅的に解明する。加えて、メタボローム解析により油脂含有率の低下に起因する代謝物量の変化を網羅的に解明する。

Causes of Carryover

当初は本年度に予定していた変異株スクリーニング実験の実施が遅れたため、次年度使用が生じた。次年度に変異株スクリーニング実験にかかる物品費として使用する予定である。