2020 Fiscal Year Research-status Report

ヒトデ幼生の自己・非自己認識に関わる種特異的糖鎖の探索

Research Project

Project/Area Number	20K15602
Research Institution	Keio University
Principal Investigator	古川亮平慶應義塾大学, 文学部(日吉), 助教 (90458951)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2023-03-31
Keywords	棘皮動物ヒトデ / 幼生 / 自己非自己認識 / 種特異的糖鎖 / 免疫 / 精子
Outline of Annual Research Achievements	申請者の先行研究により、棘皮動物イトマキヒトデの幼生において唯一の免疫細胞である間充織細胞が、同種異個体のみならず本来幼生の体内に存在しない精子であっても、生きた同種の細胞であれば免疫応答を生じない「missing-species(種の喪失)認識」によって自己と非自己を識別している可能性が示唆されている。この認識システムを可能にするには、自己マーカーに相当する種特異的な分子の存在が必要であるが、申請者は、予備データからこの分子が何らかの糖鎖であることまでは突き止めていた。本研究は、イトマキヒトデの精子を材料に、幼生のmissing-species認識を可能にする種特異的な糖鎖を探索し、その単離・同定を目指すものである。今年度は、各種レクチンを用いたスクリーニングを中心に行った。スクリーニングの方法は、各種レクチンを結合させた生きた精子を幼生体内に顕微注射し、間充織細胞による貪食作用の有無を調べた。これまで７種の主要なFITC標識レクチン（ConA、DBA、PNA、RCA120、SBA、UEA-1、WGA）を結合させた精子を顕微注射したところ、ConA結合精子に対して比較的強い貪食作用が観察された。一方、ConAと同等の染色性を示したSBA結合精子に対する貪食作用はほとんど認められなかった。ただし、SBAを含め他のレクチンを結合させた精子が全く貪食されなかったわけではなく、レクチン染色時の操作が精子の生存性に影響を及ぼした可能性を完全に排除することはできない。各種糖鎖切断酵素処理で処理した精子の顕微注射実験については、ノイラミニダーゼによるシアル酸類の切断を試みたが、おそらく界面活性剤の影響により精子の生存性が非常に低く、条件検討は難航している。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 主な理由は、新型コロナウイルス感染症によるキャンパス閉鎖等の措置により、前半はほとんど研究に着手できなかったためである。研究再開後は、レクチン染色を施した精子によるスクリーニングを集中的に行い、ポジティブなデータが得られ始めている。従って、研究遂行において問題になるほどの遅れではないと考えている。
Strategy for Future Research Activity	レクチン染色を施した精子の顕微注射によるスクリーニングは、現在ポジティブなデータが得られ始めておりこれを引き続き継続して行う。特にConAについては、特異糖であるマンノースとの同時注射によって、間充織細胞による貪食作用が抑制されるかも検討する。同時に、他のマンノース結合レクチンでも貪食作用が更新されるかを検証する。並行して、種々の糖をバクテリア等と同時に注射した際、貪食作用が抑制される糖がないかを検証することにより、マンノース結合レクチン以外のレクチンも探索する。当初の計画では糖鎖切断酵素処理を施した精子に対する貪食作用を指標に、missing-species認識を可能にする糖鎖を探索することであったが、　現在、酵素処理した際の精子の生存性の担保が最大の問題となっている。そこで、今年度は、酵素処理で精子から遊離させた糖鎖を糖鎖補足ビーズに結合させ、これを幼生に顕微注射する戦略で進める予定である。
Causes of Carryover	新型コロナウイルス感染症による昨年度前半のキャンパス閉鎖等の措置により、研究開始に遅れが生じた。また、精子の糖鎖切断酵素処理実験が当初の想定より難航したため、研究計画で計上していた各種酵素の購入を見送るとともに、その後の実験として予定していた糖鎖補足ビーズを用いた実験にも着手できておらず、これらの実験に係る消耗品への支出が大幅に減った。今年度は、糖鎖切断酵素処理を施した精子ではなく、切断された遊離糖鎖を補足したビーズの顕微注射実験を中心に進めるため、次年度使用額の多くは、糖鎖補足ビーズの購入に使用する予定である。