2020 Fiscal Year Research-status Report
Establishment of mouse model for bovine coronavirus infection to accelerate development of live vaccines
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20K15661
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| Research Institution | Gifu University |
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Principal Investigator |
中川 敬介 岐阜大学, 応用生物科学部, 准教授 (90853250)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 牛コロナウイルス / マウスモデル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
牛コロナウイルスは成牛および幼牛に呼吸器症あるいは下痢症を引き起こす。牛以外に本感染症の病態を再現する動物モデルが存在しないため、本ウイルスの病態解析や弱毒生ワクチン株の樹立が進んでいない。本研究の目的は、１）本ウイルス感染症を再現するマウスモデルの作出 ならびに ２）弱毒生ワクチン候補株の作出およびその評価 である。2020年度は本研究に利用する牛コロナウイルスの準備と、その感染を検出できる抗体の作成に取りかかった。
2020年に岐阜県内の畜産農家にて下痢症を呈し死亡した成牛の下痢便および気管スワブより、牛コロナウイルスの遺伝子の検出に成功した。また、次世代シークエンスを用いることで、下痢便および気管スワブ中の牛コロナウイルスゲノム配列を決定し、両由来ウイルスの配列は１００％一致することが分かった。また、ヒト肺上皮由来細胞であるHRT-18細胞を用いて、本死亡牛の気管スワブから牛コロナウイルスの分離に成功した。一方で、下痢便からは牛コロナウイルスを分離することはできなかった。
分離された牛コロナウイルスのN遺伝子情報を基に、牛コロナウイルス感染の検出への応用を目指したペプチド抗体を作成した。また、本ペプチド抗体の有効性を、ウェスタンブロッティングおよび間接蛍光抗体法により確認することができた。
弱毒生ワクチン開発によく用いられるVero細胞において、分離された牛コロナウイルスを連続継代することで弱毒生ワクチン株を作成する予定であったが、Vero細胞における分離牛コロナウイルスの増殖性が著しく低いことが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
２０２０年４ー５月にかけた緊急事態宣言に伴う大学封鎖のため、研究の開始が遅れた一方で、マウスへの接種実験を行うための材料（牛コロナウイルスおよび抗牛コロナウイルスN蛋白質ペプチド抗体）を計画通り準備することができた。２０２１年度は、これら分離ウイルスとペプチド抗体を使って、実際にマウスへの接種実験を開始する予定である。
分離された牛コロナウイルスが、Vero細胞において著しく低い増殖能を示したことから、連続継代による牛コロナウイルスの弱毒化誘導には、他の培養細胞を用いる必要があると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
HRT-18細胞にて増やした牛コロナウイルスのウイルス感染価をプラークアッセイ、あるいはフォーカスアッセイにより決定する。次いで、高ウイルス力価の牛コロナウイルスを乳飲みマウスならびに幼若マウスへ経口経鼻接種する。ウイルス接種乳飲みマウスを観察し、体重変化、致死率および生存個体の抗体価の上昇を検討する。なお、本感染実験は複数のマウス系統で
複数のマウス系統で実施する予定である。
連続継代による牛コロナウイルスの弱毒化誘導に利用する細胞として、複数のコロナウイルス種において良好な増殖性が確認されているVeroE6 TMPRSS2細胞を検討する予定である。なお、VeroE6 TMPRSS2細胞については既に分与済みである。
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| Causes of Carryover |
次年度に使用する研究費（3739円）が生じたものの、大きな金額ではなく次年度の実験のために有効活用する予定である。
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