新規GPIアンカー型タンパク質が解き明かす雄性妊娠制御

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K15691
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 渡邊 仁美 京都大学, 医生物学研究所, 助教 (80624056)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: マウス精子 / GPIアンカー型タンパク質 / 受精 / 妊娠制御

Outline of Annual Research Achievements

我々は、骨格筋から同定した新規GPIアンカー型タンパク質MuGPI-APについて、その機能を生体レベルで解析するために、ノックアウトマウス（KOマウス）を作製し表現型を観察したところ、雄KOマウスと野生型雌マウスの交配で、１出産あたりの産仔数が有意に増加することを見出した。本研究では、この現象の分子機構を解析することで、雄性因子による新たな妊娠制御メカニズムを明らかにしたい。前年度はMuGPI-AP KO精子についてin vitroでの性状解析を行い、この精子は直線運動性が野生型に比べて向上していることを認めた。しかしながら体外受精においては有意な差が認められず、KOマウスでの表現型を説明するにいたらなかった。今年度はまずMuGPI-APの精子受精能獲得プロセスでの分子動態について調べた。野生型マウスの精巣上体から精子を採取し、受精能獲得培養液(HTF)と非獲得培養液(PBS)にてインキュベートし、精子表面のMuGPI-APの発現を特異抗体を用いてFACS解析した。その結果、HTF30分インキュベートにて精子表面での発現が最大になり、120分後ではほぼ消失した。一方PBSでのインキュベーションではどの時間経過においても精子表面での発現は認められなかった。このことからMuGPI-APは精子の受精能獲得プロセスにおいて一過性に精子表面に露出し、その後遊離・消失と考えられた。一方、このプロセスにおいて他のGPIアンカー型タンパク質についても同様のFACS解析を行い、そのいくつかは精子表面に露出することを認めたが、時間経過とともに消失するものはなかった。このことは、今後MuGPI-APの機能解析を進めるうえで有力な示唆をあたえる。
また、MuGPI-APの精巣内での発現細胞をデータベース検索により調べたところ、パキテン期精母細胞および円形精子細胞で発現し始めることがわかった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初掲げた個別課題のうち以下の２課題はおおむね解析が完了した。
１）MuGPI-AP発現細胞の同定→データ解析の結果、発現細胞はパキテン期精母細胞および円形精子細胞であることが判明した。
２）MuGPI-AP KOマウス精子のin vitro機能解析→この結果MuGPI-APは精子の直線運動性を制御しているが、受精能には直接関与しない。
これらに加えて、予想外の成果として、MuGPI-APは精子の受精能獲得プロセスにおいて一過性に精子表面に露出し、その後遊離・消失することがわかった。これは他のGPIアンカー型タンパク質と異なる性質であり、今後MuGPI-APの機能解析を進めるうえで有力な示唆となる。

Strategy for Future Research Activity

今後は、これまでの研究成果をヒントに、生体内でのMuGPI-APの機能解析を主に以下の観点で進める。
１）MuGPI-AP KOマウス精子の人工授精による生体内機能解析：KOマウス精子を排卵誘発した雌マウスの膣内に注入して人工授精を行い、生体内での受精能を調べる。
２）MuGPI-AP発現精子およびKO精子のタンパク質発現解析：MuGPI-APを膜表面に発現している精子及びKO精子の精子表面タンパク質を300種類のモノクローナル抗体を用いてFACS解析を行い、それぞれに特異的に発現上昇あるいは発現低下しているタンパク質を同定する。
３）重要分子KOマウス作製と機能解析：上記のタンパク質発現解析から同定された興味深い分子について、CRISPR-Cas9ゲノム編集法を用いてノックアウトマウスを順次作製し、精子受精能について調べる。