2020 Fiscal Year Research-status Report
翻訳速度変化を介した新生タンパク質の折畳み機構の解明とその応用
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20K15709
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| Research Institution | Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University |
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Principal Investigator |
佐古 博皓 沖縄科学技術大学院大学, 細胞シグナルユニット, 特別研究員 (80793570)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 翻訳速度 / 新生鎖 / タンパク質変性 / miRNA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
miRNAは標的mRNAに結合し、mRNAの分解や翻訳抑制を亢進することが広く知られている。本研究では、多面的なビックデータ解析と分子・生化学的手法により、一部のmiRNAは、標的のmRNA分解や翻訳抑制ではなく、リボソームの翻訳速度を局所的に遅くすることで、新たに生まれたタンパク質の折り畳みを促進しているという概念を提唱し検証することを目的としている。
前年度までは、ビックデータ解析により、mRNAのCDSに結合するmiRNAは、標的の分解や翻訳を抑制することなく、リボソームの速度を一時的に遅くさせる機能を持つことを示唆することができた。さらに、新生鎖のミスフォールディングに脆弱なレポーターを作成することにより、miRNAの減少が新生鎖の変性に与える影響を生化学的に検証できた。具体的には、グローバルなmiRNAの減少、もしくはレポーターの一部に結合するmiRNAの特異的な抑制により、レポータータンパク質の凝集が増加し、半減期も短くなるという結果を得た。
今年度は、レポーターの一部に特異的に結合する非切断型shRNAと非切断型siRNAにより、レポータータンパク質の凝集が減少し、シクロヘキサミドチェイスによるタンパク質の安定性の検証においても、非切断型shRNAと非切断型siRNAによりレポータータンパク質の半減期が長くなるという結果も得られた。これらのことから、一部のmiRNAは標的の発現量を負に制御することなく、翻訳中のリボソームの速度を局所的に調節することで新生鎖の折り畳みを補助しているという可能性が明らかにすることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の研究計画では研究課題期間内に、miRNAのレポータータンパク質の折り畳みに対する影響を①グローバルなmiRNAの減少、②レポーターに結合するmiRNAの阻害、③miRNA mimicによるレスキュー、の３ステップにおいて生化学的に検討し、最終的に④内在性のタンパク質における同様の機序の有無の検討が含まれていた。今年度までに、①から③の研究課題を検討することができているため、本研究はおおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
miRNAがどのような作用機序でリボソームの翻訳速度を調節し新生鎖の折り畳みに寄与しているのかを明らかにする必要がある。
また、本研究で用いたレポーターにはCFTR遺伝子のNBD1ドメインが用いられているが、レポーターの凝集や半減期を改善した非切断型shRNAと非切断型siRNAが、CFTR遺伝子の単一遺伝子疾患であるcystic fibrosisに対しても有用であるかの検討も考えられる。
さらには、レポータータンパク質以外の、内在性タンパク質においてもmiRNAによる同様の機序が存在するを検討するために、網羅的なスクリーニング方法の確立も考えている。
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| Causes of Carryover |
当初、リボソームプロファイリングなどの次世代シークエンス関連費として計上していた試薬品費と受託費用などにおいて、プロトコルの改善や効率的なマルチプレックスの利用などにより、大幅に経費を削減できた。そのため余剰分を次年度使用分として、本来の研究計画では予定していなかった詳細な作用機序の解明に当てることができる。
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