2021 Fiscal Year Research-status Report
in vivo光架橋法による生細胞内での新生ポリペプチド鎖の迅速な動態変化の解析
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20K15715
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| Research Institution | Nara Institute of Science and Technology |
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Principal Investigator |
宮崎 亮次 奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 助教 (30827564)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 新生ポリペプチド鎖 / in vivo光架橋法 / VemP / 翻訳伸長停止 / Secトランスロコン / PpiD / YfgM |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質が機能するためには、合成後に適切な場所に輸送され、適切な構造を形成する必要がある。この過程は、翻訳完了後にリボソームから離れた後だけではなく、翻訳途上時のリボソームと結合した新生ポリペプチド鎖の状態でも進行する。最近、新生鎖自身が機能を有することも明らかになり、新生鎖の構造状態や細胞因子との相互作用の理解は重要性を増しつつある。しかし、生細胞内で迅速に進行する新生鎖の動態変化を解析した報告はほとんどない。
本研究は、新生ポリペプチド鎖状態が安定なVemPをモデル基質とし、in vivo光架橋法を用いて細胞内での迅速な新生鎖の相互作用動態変化の解析を行う。それにより、未解明のVemPの翻訳停止解除の分子機構を明らかにすると共に、生細胞内での新生ポリペプチド鎖の迅速な相互作用の動態変化を分子レベルで解析できることを実証することを目的とする。
前年度に、VemPの全領域を対象とした系統的な光架橋解析を行った結果、リボソームタンパク質やSecトランスロコンの構成タンパク質以外に、シグナル認識粒子とPpiDがVemPと直接相互作用することを示した。PpiDは機能がほとんど分かっていない内膜タンパク質で、YfgMという機能未知因子と安定な複合体を形成する。そこで、当該年度では、①YfgMの機能解析を行い、PpiD同様にVemP翻訳停止解除に働くことを見出した。また、系統的な光架橋解析から、PpiD/YfgM複合体相互作用様式とYfgMとSecトランスロコンとの相互作用の分子様式を明らかにした。②PpiDを対象とした系統的な光架橋解析から、VemPなどの基質が結合すると思われる領域を同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
タンパク質の多くは、翻訳途上時のリボソームと結合した新生鎖の状態で様々な因子と相互作用し、それにより成熟していく。また、新生鎖自身が機能分子として多くの細胞機能に関与することが明らかになってきており、細胞内での新生鎖の迅速な相互作用動態の理解は更に重要となっている。
本研究は、細胞内で翻訳が安定に停止する翻訳伸長停止配列をもつVemPをモデル基質とし、in vivo光架橋法を用いてVemP新生鎖の相互作用因子の同定とそのダイナミックな相互作用動態の解析を行い、それを通じて、細胞内で新生ポペプチド鎖の迅速な相互作用動態を解析できることを実証するものである。
前年度には、計画を順調に進め、大部分の計画を完遂した。当該年度は、新生鎖と相互作用する因子側に着目し、機能未知の膜タンパク質PpiDとそのパートナー因子YfgMに着目して、その役割を調べた。その結果、YfgMがPpiD同様にVemPの翻訳アレスト解除に働くこと、YfgMとPpiDの相互作用の詳細を明らかにすることができた。加えて、PpiDを対象とした予備的な光架橋解析から、VemPを含めた基質相互作用部位やPpiD相互作用する未知因子の情報などを得ることができた。
以上のように、本年度はおおむね順調に研究が進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年度の研究から、VemPをモデル基質とし、in vivo光架橋法を用いて細胞内での迅速な新生鎖の相互作用動態変化の解析を行うことができることを示した。これは、細胞内での翻訳途上ポリペプチド鎖の相互作用様式やその動態の解析の基盤となりうる研究である。加えて、当該年度の研究では、VemPの相互作用相手側、特に機能がほとんど未解明の膜タンパク質PpiDとそのパートナー因子YfgMに焦点をあて、その機能解析や相互作用解析を行い、PpiD/YfgMがVemP翻訳停止解除に重要であることやPpiDの基質結合に関わると思われる領域を同定した。
今後はVemPをモデル基質として利用し、VemPと架橋しうるPpiDpBPAを用いてその動的な相互作用を解析し、VemP新生鎖の膜透過機構をさらに詳細に解析する。また、PpiD/YfgM複合体は構造が分かっていないため、その構造やSecYEGトランスロコンや膜透過促進因子SecDF、VemP新生鎖との複合体の構造決定を試みる。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染症の流行に伴う研究活動の一時的な停止により、当初の計画よりも実験に費やす時間が減少し、また学会参加の制限なども相まって次年度使用額が生じた。
2021年度の残額については、得られた予備的成果の検証などに使用する。
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