2021 Fiscal Year Research-status Report
普遍的に存在する三本鎖核酸構造が起こすゲノム不安定性
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20K15721
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| Research Institution | Aichi Cancer Center Research Institute |
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Principal Investigator |
上原 了 愛知県がんセンター(研究所), 腫瘍制御学分野, 研究員 (70842590)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | RNase H2 / R-loop / ゲノム不安定性 / 自己免疫応答 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
R-loopは転写されたRNAが二本鎖DNAに侵入して形成する三本鎖構造で、ゲノム上に普遍的に存在し、遺伝子発現の制御を担っている。一方で、その分解が滞ると複製ストレスやゲノム不安定性を増大させ、自己免疫疾患やがんといった疾患の原因になると考えられている。RNase H2はR-loopの主要な分解酵素であると同時に、複製時にDNAポリメラーゼが染色体DNA上に取り込んだ単一リボヌクレオチド（rNMP）を除去する別の活性を持つ。RNase H2の遺伝子をノックアウトした細胞ではR-loopとrNMPが混在する形で蓄積するため、R-loopが及ぼす影響をrNMPと区別できない。R-loopの生理的役割を詳細に解析するため、研究代表者らは立体構造情報を基にR-loop分解活性のみを低下させたRNase H2変異体（HD）を設計した。CRISPR-Cas9を用いてHEK293のRNase H2遺伝子に変異導入を行い、ホモ型HD変異を持つHD細胞とRNase H2をノックアウトしたKO細胞を作製した。コメットアッセイによるDNA損傷試験ではHD細胞はKO細胞よりDNA損傷が遥かに軽微であることが分かった。
また、RNase H2が２つの異なる基質を認識する分子機構を解明するために超好熱性アーキアPyrococcus abyssi由来のRNase H2（PaH2）を大腸菌で発現・精製し、X線結晶構造解析を行った。PaH2は酵素単独では結晶が得られなかったが、人工結合タンパク質と共結晶化することで最大分解能2.69Åで構造決定に成功した。PaH2の活性中心には二分子の人工結合タンパク質が結合しており、活性部位のループ構造がR-loop分解活性を持たない細菌由来の酵素とは異なることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
HD細胞を用いてR-loopがDNA損傷に及ぼす影響をrNMPと区別して測定することに成功した。PaH2のX線結晶構造解析に成功し、R-loop分解活性に重要な活性中心の構造を推定することができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はHD細胞における自己免疫応答やDNA損傷応答に関する遺伝子発現を調べる。また、KO細胞に様々な活性を持つRNase H2変異体の遺伝子導入を行い、2種類の活性の高さと遺伝子発現やDNA損傷との相関を明らかにする。さらにPaH2の基質―酵素複合体の結晶構造解析を行い、RNase H2がR-loopを認識する分子機構を調査する予定である。
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| Causes of Carryover |
今年度は予定していた受託解析を次年度に行うよう計画を変更したこと、X線結晶構造解析の実験を中心に行ったため予想以上に物品費の使用が少なかったことなどから次年度持ち越しが生じた。余剰分は次年度の受託解析費用に充てる予定である。
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Research Products
(4 results)
