2023 Fiscal Year Research-status Report

分裂酵母のDDKとNDR kinaseによる胞子細胞膜新生の新奇制御メカニズム

Research Project

Project/Area Number	20K15752
Research Institution	Suzuka National College of Technology
Principal Investigator	今田一姫鈴鹿工業高等専門学校, 生物応用化学科, 准教授 (70793587)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2025-03-31
Keywords	Dbf4-dependent kinase / 分裂酵母 / 胞子形成 / SPB
Outline of Annual Research Achievements	分裂酵母の胞子形成は、母細胞の“中”で新たな細胞が形成される興味深い現象である。この胞子の細胞膜は、中心体にあたる構造物・スピンドル極体（SPB）の細胞質側から、第二減数分裂の開始とともに形成され始める。本研究は、この胞子の細胞膜新生を開始させるSPB上のシグナル伝達経路を解明することを目的とする。申請者らはこれまでに、Dbf4-dependent kinase (DDK)ホモログSpo4-Spo6が、何らかの基質のリン酸化によって胞子の細胞膜新生を開始させることを見出している。また、細胞質分裂から極性成長に切替えるMorphogenesis Orb6 network (MOR)と、核の分裂後に細胞質分裂を開始させるSeptation initiation network(SIN)という、2つのNDR kinaseが関与するシグナル経路が、胞子形成時にSpo4-Spo6と遺伝的相互作用を示すことを明らかにしている。昨年度までに、触媒サブユニットSpo4のリン酸化能が、SINの活性化に関わる因子や、胞子形成に関わる因子のSPB局在に影響を与えることを見出している。しかしながら、Spo4-Spo6のSPB局在の足場や、リン酸化ターゲットといった直接的な相互作用に関する情報は未だ得られていない。Spo6とSIN等のSPB局在因子のイーストツーハイブリッドアッセイでも相互作用は検出されておらず、Spo6とSPB局在因子の相互作用は減数分裂・胞子形成の時期の分裂酵母細胞でにのみ見られると考えられた。そこで、この時期の細胞破砕液を用いたプルダウンアッセイにより物理的相互作用の検出を試みるため、Spo6とその結合ターゲット候補因子のタグ付けを行った。今後、同調的に減数分裂・胞子形成を誘導し、アッセイを行う。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason SIN因子にタグ付け済みの菌株を頂き調べてみたところ、タグが抜け落ちていると考えられる結果となり、アッセイに供するための菌株として使用することができなかった。そのため材料作りに終始しており、Spo6とSIN因子の物理的相互作用の検出やリン酸化ターゲットの特定には至っていない。そのため、やや遅れていると判断した。
Strategy for Future Research Activity	Spo6のSPB上での足場からターゲット候補を絞るため、SINの足場をAIDシステムにより分解した時のSpo6の局在観察を試みる。また、タグ付きのSIN因子とSpo6を発現している細胞で同調的に減数分裂誘導が行えるように、2倍体細胞を作製する。この細胞を用いて、プルダウンアッセイにより、Spo6とSIN因子の物理的相互作用の検出を行う。Spo6とタグ付きSIN因子以外のタンパク質バンドが得られた場合、タンパク質同定を行い、本当に結合するのかを確かめる予定である。
Causes of Carryover	タグ付け済みの菌株が使用できない状態であったこと、遺伝子操作に係る機器に不具合が生じたことにより、材料作製に時間を費やしてしまった。一方、学生指導に係るエフォートが例年より大きく、思うように本研究が進まなかった。