2021 Fiscal Year Research-status Report
１分子レベルでのクロマチン構造の動的変化の解析技術の開発
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20K15760
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| Research Institution | Tokyo Denki University |
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Principal Investigator |
高橋 俊介 東京電機大学, 理工学部, 助教 (50778967)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | １分子イメージング / クロマチン / 蛍光顕微鏡 / DNA形態制御 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
クロマチンからなるDNAの高次構造は状況に応じて局所的に折り畳みや弛緩が生じ、遺伝子発現や染色体機能を制御している。これまでの研究ではクロマチン構造の動的な変化を捉えるための有用な解析技術が確立されていないのが実情である。このため、個々のヌクレオソームの位置や動体変化の過程やそれらがDNA複製などに与える影響を解析することが困難である。
この問題を解決するために、本研究では、１分子レベルでクロマチン構造の再構成実験系を開発する。2021年度では、１分子レベルでのクロマチン再構成の予備実験として、試験官内でのクロマチン構造の再構成を実施した。４種類のコアヒストンとクロマチン形成因子NAP-1やATP要求性クロマチンリモデリング因子を用いて、試験管内で超らせん状態下での環状DNAに対してクロマチン構造を再構成した。形成クロマチンは、ミクロコッカスヌクレアーゼによって切断した結果、ヌクレオソーム単位でのDNA断片化のバンドが得られた。以上のことから、試験官内でのクロマチン構造の再構成に成功した。また、１分子レベルでのDNA分子及びクロマチンの動的挙動を捉えるため、１分子イメージングに最適な独自顕微鏡システムを開発した。本顕微鏡装置は標的対象物に適合した検出システムへと改良することができ、１分子イメージングという特殊な系において最適である。開発した独自顕微鏡システムが安定的に首尾良く働くことを評価するため、マイクロ流体デバイス内でのラムダDNAの直接観察したところ、安定的にDNA１分子が直接観察された。以上から、１分子レベルでのクロマチン構造の動的挙動のイメージングの準備が整った。
最終年度では、１分子レベルでのクロマチン構造を再構成し、１分子イメージングを実施していく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2021年度では、１分子レベルでのクロマチン再構成の予備実験として、試験官内でのクロマチン構造の再構成を実施した。４種類のコアヒストンとクロマチン形成因子NAP-1やATP要求性クロマチンリモデリング因子を用いて、試験管内で超らせん状態下での環状DNAに対してクロマチン構造を再構成した。形成クロマチンは、ミクロコッカスヌクレアーゼによって切断した結果、ヌクレオソーム単位でのDNA断片化のバンドが得られた。以上のことから、試験官内でのクロマチン構造の再構成に成功した。また、１分子レベルでのDNA分子及びクロマチンの動的挙動を捉えるため、１分子イメージングに最適な独自顕微鏡システムを開発した。本顕微鏡装置は標的対象物に適合した検出システムへと改良することができ、１分子イメージングという特殊な系において最適である。開発した独自顕微鏡システムが安定的に首尾良く働くことを評価するため、マイクロ流体デバイス内でのラムダDNAの直接観察したところ、安定的にDNA１分子が直接観察された。以上から、１分子レベルでのクロマチン構造の動的挙動のイメージングの準備が整った。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度では、２０２１年度では１分子イメージングのための独自顕微鏡システムの開発を実施した。しかし、この実験系では、１分子イメージングでは背景光により対象物が観察できない問題が生じている。そこで、最終年度では、１分子イメージング顕微鏡装置に全反射照明ユニットを実装することで、この問題を解決する。また、２０２１年度で試験官内でのクロマチン構造の再構成実験によってクロマチン形成が得られたことから、これを１分子実験系に落とし込むことで、1分子レベルでのクロマチン構造の再構成を実施し、直接観察を行う。安定的に1分子レベルでのクロマチン構造の直接観察が実施できた後に、1分子レベルでのヌクレオソーム構造の動的挙動の観察をすることで、1分子レベルでのクロマチン構造の再構成系の開発を実施していく。
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