数十個のセルロース合成酵素複合体から１本のセルロース繊維が形成される仕組み

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K15763
• Research Institution: Japan Women's University
• Principal Investigator: 吉田 徹 日本女子大学, 理学部, 助教 (30724546)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: バクテリアセルロース / Cryo-ET / ミニセル

Outline of Annual Research Achievements

バクテリアが産生するセルロース（バクテリアセルロース）の合成と分泌は、内膜上の合成酵素と外膜上の分泌装置を含むタンパク質複合体によって行われる。このターミナルコンプレックス（TC）と呼ばれるタンパク質複合体は細胞膜上に複数配置されており、各TCから分泌されたセルロース鎖が細胞外で集まって最終的に１本の繊維を形成する。しかし、セルロース鎖がどこでどのように束になるのかはよく分かっていない。そこで本研究では、細胞膜上に配置されたTCの構造を解明するために、バクテリアのミニセルを低温電子顕微鏡を用いたトモグラフィー法により観測する。バクテリアには、セルロースを産生することで有名な酢酸菌Komagataeibacter xylinusを用いた。本年度はミニセル作製に向けた下記２つの実験を行った。
（1）酢酸菌のMin遺伝子欠失によるミニセル作製。ミニセルを作製する手段の一つとしてMinCDEオペロンの破壊が知られている。MinCDEオペロンを相同組換により抗生物質耐性遺伝子に置き換えることで、ミニセルと思われる小さな細胞の作製に成功した。
（2）酢酸菌のMreB遺伝子変異による薄い細胞の作製。大腸菌ではMreBタンパク質への変異導入により、細胞が薄くなることが知られている。そのため、MreBタンパク質に変異を導入し、さらにMin遺伝子を欠失させることで、より小さなミニセルを作製することが出来る。相同組換によりMin遺伝子への変異導入を試みた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

酢酸菌のミニセルと考えられる小さな細胞の作製に成功したが、本当にミニセルである確証がまだ得られていない。また、MreBタンパク質への変異導入がうまく出来ず、試行錯誤を続けている。

Strategy for Future Research Activity

MreBへ変異導入することでより小さなミニセルの作製を目指していたが、Min遺伝子の欠失により得られた小さな細胞は、トモグラフィーによる撮影条件を満たす大きさであった。そこで今後は、MreBへの変異導入を中断し、Min遺伝子の欠失により得られた小さな細胞を用いて実験を進めることにする。まず、得られた小さな細胞が本当にミニセルであることを、光学顕微鏡と電子顕微鏡により確認する。確認できた場合、ミニセルがTCを構成するタンパク質を有しているかどうかをウエスタンブロッティングにより確認する。その上で、低温電子顕微鏡を用いたトモグラフィー法を行う。

Causes of Carryover

次年度にミニセルのトモグラフィー撮影を行うため、本年度の支出を抑えた。