2021 Fiscal Year Research-status Report

Developing a new genome-editing tool using anti-CRISPR proteins

Research Project

Project/Area Number	20K15777
Research Institution	Kyoto University
Principal Investigator	弘澤萌京都大学, iPS細胞研究所, 特定研究員 (10849566)
Project Period (FY)	2020-04-01 – 2024-03-31
Keywords	CRISPR-Cas / Anti-CRISPR protein
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、抗CRISPRタンパク質（Acr）を Casタンパク質に対するリクルーターとして再構築し、新規ゲノム編集のツールとすることを目指している。昨年度に、AcrllA5に転写活性化因子であるVPRを融合させることで標的遺伝子の活性化を達成した。そこで、本年度は遺伝子の活性化以外の事が可能であるかどうかを検証した。まず、CRISPRiを簡便に確認するためのレポーター系（GFPの発現を抑制する系）の構築を行った。その後、AcrllA5に転写抑制化因子であるKRABを融合することで遺伝子の抑制化ができないかどうかをレポーター系により検証した。しかしながら、ただ単にAcrllA5にKRABを融合したコンストラクトでは、レポーター遺伝子の発現を抑制することができなかった。そこで、転写抑制化因子の能力を強化することで上記問題が解決できないかと考え、転写抑制化因子を大量にリクルートする戦略をとった。結果、レポーター遺伝子の発現を抑制化することに成功した。しかしながらその抑制化効率は期待したほど高くはなかった。改良の余地はあるが、上記結果は前年に引き続きAcrllA5に任意のタンパク質を融合させることでSpCas9に任意のタンパク質をリクルートできる可能性を支持するものである。以上より、Acrに任意のタンパク質（ここでは転写活性化因子や抑制化因子）を融合させることでAcrを介した遺伝子の活性化/抑制化が可能であることを実証し、Acrを介した機能制御の範囲を拡大することに成功した。ゲノム編集ツールの拡張は本分野において重要であり、本成果もそれに貢献できているのではないかと思われる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 昨年度にAcrllA5にVPRを融合させSpCas9にリクルートでき、それによって標的遺伝子の活性化が可能なことが示せたので、本年度は別の機能を付与できないかを検証した。そこで、標的遺伝子の抑制化を達成することを目指した。AcrllA5に遺伝子抑制化ドメインであるKRABをただ単に融合させるだけでは標的遺伝子の抑制化を行うことが難しいことが明らかとなった。そこで、MoonTag Systemを用いることで大量のKRABドメインをAcrllA5に集積させる戦略を取ることで標的の遺伝子発現を抑制化することに成功した。また、遺伝子の活性化や抑制化のみならず、塩基編集を行うことができないかを検討している。まずは、遺伝子の活性化・抑制化それに加えて、塩基編集を行えることを示し、proof of conceptとしAcrによる新規ゲノム編集法としていきたい。 AcrllA5の機能拡張（標的遺伝子の抑制化）を可能にすることができたことより、現在までの進捗状況としては「おおむね順調に進展している」とした。
Strategy for Future Research Activity	AcrllA5にVPRやKRABを融合させることで遺伝子活性化や抑制化が可能となった。そこで、遺伝子の活性化や抑制化のみならず塩基編集もできないか検討する。具体的にはTadAなどをAcrllA5に融合させレポーター遺伝子の塩基が編集されたかどうかを確認する（GFP遺伝子の塩基を変化させることでBFP遺伝子にする）ことで検証する。また、本成果を論文としてまとめていく。加えて、可能であればこれまでに作製したコンストラクトを改善できないかを検討する。
Causes of Carryover	本来であれば、実験関連や学会関連等で使用する予定であった。しかしながら、昨年に引き続く新型コロナウイルスのため当該助成金が生じた。使用計画としては、昨年同様、助成金を物品費（細胞培養関連、研究関連書籍等）とその他（研究成果発表費）に大きく割り振る事を考えている。