2021 Fiscal Year Research-status Report
線虫の精子特異的なタンパク質のアルギニンメチル化による制御機構の解析
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20K15799
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
田島 達也 筑波大学, 生存ダイナミクス研究センター, 助教 (80845058)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 線虫 / 精子 / アルギニンメチル化 / 塩基性タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質アルギニン残基（Arg）のメチル化はリン酸化に次ぐ主要な翻訳後修飾のひとつであり、遺伝子発現、RNAスプライシングやシグナル伝達など様々な細胞内イベントに関与している。この化学反応は、タンパク質Argメチル基転移酵素（PRMT） によって触媒されており、線虫（C. elegans）の場合、非対称型ジメチルArg（ADMA）はPRMT-1、対称型ジメチルArg（SDMA）はPRMT-5がそれぞれ合成する。しかし、Argメチル化が生殖機能を制御しているかどうかは不明な点が多い。
当研究室のin vitroメチル化実験より、PRMT-1は精子特異的な塩基性タンパク質であるSPCH-2およびSPCH-3をメチル化することを発見して、その部位が43位Argであることを同定した。また、変異体を用いた表現型解析では、spch-2変異体の産子数について野生型より大きく減少しており、生殖機能に大きく寄与していた。本研究では、「線虫の雄性生殖細胞系列におけるSPCHの機能解析およびSPCHのArgメチル化修飾の生理機能の解明」について組換えタンパク質や線虫を用いて生化学的手法と遺伝学的手法を組み合わせて検証する。令和3年度の研究実績は以下のとおりである。
1.spch-2変異体オスを解剖して精細胞を放出させると野生型と比較して産生量が顕著に減少していた。次に、精細胞にin vitro activatorとして知られているPronaseを加えて精子形成を惹起させると、哺乳類精子の鞭毛に相当する偽足が短くなっていた。これらの結果は、精細胞形成と精子形成の偽足の伸長に関与している可能性が示唆された。
2.SPCH-2とSPCH-3の43位Arg のメチル化が線虫の生殖に必要であるかどうかを検証するために、CRISPR/Cas9システムを用いてspch-2/spch-3 R43K 線虫を作製した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
spch変異体を用いた表現型解析については概ね順調に進んでいる。一方、CRISPR/Cas9で作製したspch-2/spch-3 R43Kについて、3回の戻し交配を行い、産子数を測定したところ、野生型と有意差がなかった。樹立した系統について、sequencingを行った結果、spch-3についてはR43Kホモ接合体となっていたが、spch-2についてはヘテロであった。このことから、SPCH-2 R43は線虫の生殖に必要な可能性が高いと予想されるが、明確な答えが得られていない。また、SPCHタンパク質とDNAまたはRNAの結合性の検証についてもあまり進んでいない。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度までに得られた結果を踏まえて、SPCHのDNAおよびRNA結合性を検証するため、ビオチン化したDNAまたはRNA断片をアビジンビーズに固定し、メチル化させた組換えSPCHを加えて、非メチル化SPCHと結合活性の比較を引続き行う。
表現型解析より、SPCH-2は線虫の精細胞形成や精子の偽足の伸長に必要であることから、その原因について詳細な解析を進める。具体的には、mitotrackerを用いて精子ミトコンドリアと精子の運動能の関係性について詳細な検証を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
昨年度と同様に、参加した学会が全てオンライン形式で開催されたため、遠征時に発生する旅費の支出がゼロとなり、予定していた所要額に達しなかった。今年度は、参加予定の学会は、現地開催する予定であるため、旅費の支出が生じると予想される。
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