2021 Fiscal Year Research-status Report
陸上植物に共通したmiR156/529-SPLモジュールの分子メカニズムの解明
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20K15814
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
都筑 正行 東京大学, 大学院総合文化研究科, 助教 (40845616)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | マイクロRNA / 成長期移行 / SPL / ゼニゴケ / シロイヌナズナ / 転写因子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、陸上植物に保存されたmicroRNA156/529 (miR156/529)とSPL転写因子による成長期移行モジュールに着目し、どのような分子メカニズムによって成長期移行を促進しているのかを明らかにすることを目的としている。これまでの研究により、被子植物シロイヌナズナとコケ植物 ゼニゴケ共通にmiR156/529によるSPL転写因子の発現抑制が正常な成長期移行に重要であることが明らかになったが、生活環や体制の大きく異なる植物種間で分子メカニズムが共通しているかは不明であることから、シロイヌナズナとゼニゴケの2種類の系統的に離れたモデル植物を材料とすることで、疑問の解明に取り組む。
令和3年度は、より実験結果を得やすいと考えられるin vitroでの転写因子結合領域の同定を試みた。まず無細胞系タンパク質合成系を用いてゼニゴケSPL2タンパク質を合成することに成功した。次にこのタンパク質とゲノムDNAを相互作用させ、結合度の高いDNAを精製、そして次世代シーケンシング解析により、網羅的に同定を行った。得られた塩基配列データに対してインフォマティクス解析を行い、特徴付けを行った。SPL2タンパク質はSBP-box転写因子ファミリーに属することから既知のシス配列が濃縮されていることが期待されたが、予想に反して濃縮された配列は異なるものであった。対照実験としてシロイヌナズナにおけるホモログタンパク質を用いて同様の解析を行った結果、こちらにおいては予想通りシス配列の濃縮を観察することができたことから、SPL2タンパク質における実験結果が何を示しているのかを検討する余地がでてきた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和2年度に引き続き、in vivo ChIP解析でのSPL2標的領域の同定の条件検討を行っていたが、SPL2の発現量の少なさから検出が困難であった。そのため、代替となる方策として、in vitroでのSPL2タンパク質の発現および標的DNA候補領域の同定を行う方法に切り替えて実験を進めた。
解析の結果、in vitroでのSPL2タンパク質の発現および結合DNAを次世代シーケンシングにより検出することができた。その後、結合DNA領域の解析を行った結果、既知のSPL転写因子のシス配列が濃縮されていなかったことから、SPL2の結合DNA領域の網羅的検出ができたかどうかに関しては、結論づけることができていない状況である。コントロールとしてシロイヌナズナのホモログタンパク質を用いて同様の実験および解析を行ったが、この場合においては既知のシス配列の濃縮が見られた。このことから、少なくともシロイヌナズナのタンパク質における実験系はうまくはたらいていることが担保されたが、ゼニゴケのSPL2タンパク質あるいはゲノムDNAが持つ何らかの特徴が実験結果に影響している可能性が考えられた。またシス配列が濃縮されていない結果が実際のSPL2タンパク質のはたらきを表している可能性も考えられることから、引き続き解析を進めていく。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和3年度のin vitroでのSPL2タンパク質の標的領域の結果を踏まえて、さらに解析をすすめる。まず解析結果が非特異的な結合を検出しているのか、実際のSPL2タンパク質の機能をある程度反映しているのかを明らかにするため、結合領域近くの遺伝子群を絞り、SPL2変異体における発現量の変動を確かめる。その後それらの遺伝子群の変異体を作出し、表現型を確認する。具体的には、SPL2のはたらきが報告されている成長期移行といった現象に着目して行う。
また前年度うまくいかなかったin vivoでの結合領域特定に関しても、解析をすすめる。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルスの影響で、出席する予定の学会のオンライン化に伴い旅費として計上する額が減少した。次年度は参加可能な学会等を選び、参加を増やして使用する計画である。
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