2020 Fiscal Year Research-status Report
有限成長するコケ植物２倍体メリステムの維持機構の解明
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20K15821
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| Research Institution | Rikkyo University |
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Principal Investigator |
小田原 瑛美子 (養老瑛美子) 立教大学, 理学部, 助教 (40802054)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | メリステム / ヒメツリガネゴケ / ２倍体 / 胞子体 / NLP |
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| Outline of Annual Research Achievements |
陸上植物の基部に位置するコケ植物は１倍体が優占的であるが、被子植物は２倍体が優占的である。この陸上植物の進化過程における、生活環に占める核相の割合逆転の要因の一つに、２倍体世代のメリステムが有限型から無限型への転換が推測される。そこで、コケ植物ヒメツリガネゴケの２倍体メリステムの有限性を規定する分子機構を明らかにすることを目指してきた。既にNIN-like protein(NLP)相同遺伝子の一つ、PpNLPaが、２倍体メリステムの形成制御に関わる可能性を見出していた。
令和2年度は、PpNLPa-YFP/GUSノックイン株を取得した。しかし、発現量が僅かであるためかYFP蛍光およびGUS染色が検出できず、PpNLPaの発現部位の同定に至らなかった。そこで、PpNLPaのプロモーター領域をレポーター遺伝子接続したコンストラクトをヒメツリガネゴケゲノム上のニュートラルサイトに導入した株を新たに作製し、PpNLPaが2倍体のメリステム付近と足で発現することを同定した。
また、CRISPR-Cas9系を用いたゲノム編集によりPpNLPaのDNA結合ドメインを破壊したPpNLPa変異株2株を取得し、２倍体の発生に関わる表現型を見出した。これは、既に申請時に作製済みのPpNLPa機能抑制株の表現型より少しマイルドな表現型でありながら、同様の2倍体メリステムが拡大する表現型を再現した。
PpNLPa-機能抑制株を用いたRNA-seq解析については、2倍体組織を含む茎頂からのRNA抽出の予備実験を終了しており、現在RNAのサンプリング中である。その際、野生株とPpNLPa機能抑制株に、PpNLPa-YFP過剰発現株も解析対象加え、PpNLPa機能抑制株とPpNLPa-YFP過剰発現株変動で相反する発現を示す遺伝子を２倍体メリステム維持に関わる最有力候補として同定することに変更した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
新型コロナウイルス感染拡大による令和2年度初旬の緊急事態宣言発令に伴い、大学への入校制限などの影響を受け、全体的に実験の開始に遅れが生じた。
また、申請時に予定していたPpNLPa-YFP/GUSノックイン株による発現解析でレポーター遺伝子の発現が検出できず、プロモーターレポーター株作製に変更したことによっても遅れが生じた。
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| Strategy for Future Research Activity |
CRISPR-Cas9系を用いたゲノム編集株作製が、PpNLPa単独変異株しか取得できていないため、2年目はさらに多重変異株の取得を目指し、NLPa以外の他のNLPが冗長的な機能を果たしているかを明らかにする。また、作製した誘導的なNLPa-YFP過剰発現株を用い、硝酸添加によって細胞質から核へとNLPaの局在が変化するかについての検証を行う。それにより、シロイヌナズナなどで報告されているようなNLPタンパク質の硝酸応答機能が、PpNLPにもあるか否かを明らかにしていく。
令和2年度に作製したPpNLPa-YFP過剰発現株も解析対象に加え、PpNLPa-機能抑制株と野生型、3者で令和3年度初旬にRNA-seqを行い、PpNLPaによって制御されている下流候補遺伝子の同定を進めて行く予定である。同定された下流候補遺伝子について、レポーター遺伝子ノックイン株およびゲノム編集株作製を行い、遺伝子発現パターンや表現型から、2倍体メリステムの維持制御に関わるか否かを明らかにしていく予定である。
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| Causes of Carryover |
令和2年度初旬の緊急事態宣言発令に伴い、保育園閉鎖や大学への入校制限などの影響を受け、全体的に実験の開始に遅れが生じたことによる、申請時に初年度に予定していたRNAシークエンス解析の実施が次年度に延期になったため。次年度使用額の大半は、RNAシークエンス委託費に使用する。
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