2022 Fiscal Year Research-status Report
有限成長するコケ植物２倍体メリステムの維持機構の解明
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20K15821
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| Research Institution | Rikkyo University |
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Principal Investigator |
小田原 瑛美子 (養老瑛美子) 立教大学, 理学部, 助教 (40802054)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 胞子体 / ヒメツリガネゴケ / 転写因子 / NLP |
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| Outline of Annual Research Achievements |
陸上植物の基部に位置するコケ植物は１倍体が優占的であるが、被子植物は２倍体が優占的である。この陸上植物の進化過程における、生活環に占める核相の割合逆転の要因の一つに、２倍体世代のメリステムが有限型から無限型への転換が推測される。そこで、コケ植物ヒメツリガネゴケの２倍体メリステムの有限性を規定する分子機構を明らかにすることを目指してきた。既にNIN-like protein(NLP)相同遺伝子の一つ、PpNLPaが、２倍体メリステムの形成制御に関わる可能性を見出していた。PpNLPaのプロモーターレポーター株を取得し、PpNLPa が2倍体のメリステム付近と足で発現することを同定しており、CRISPR-Cas9系を用いたゲノム編集によりPpNLPa遺伝子を破壊した変異株を複数取得し胞子体の表現型を解析することによって、PpNLPa の2倍体メリステムの維持における機能を明らかにしてきた。
令和4年度は、これまでに作製したPpNLPaの変異株や、プロモーターレポーター株、細胞分裂のマーカー株および、既知の胞子体分裂組織に関わることが明らかにされていた因子の変異株との多重変異株作製をさらに進め、２倍体メリステムの有限性を規定する遺伝学的経路の解明を試みた。細胞分裂のマーカー株については、令和4年度に新たにライブイメージングにも使用できる新たな蛍光マーカーラインも作製した。加えて、昨年度末にPpNLPa機能抑制株とPpNLPa過剰発現株、野生株の三者の若い胞子体を含む組織を用いたRNAシークエンスを実施していたため、そのデータ解析と、下流因子候補の同定を進めた。同定した下流遺伝子の候補について、既知の被子植物のNLPオルソログの下流標的遺伝子との比較を進めた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
令和3年度11月以降の産休育休取得により全体的に遅れが生じた。また、申請時に予定していたPpNLPa-YFP/GUSノックイン株による発現解析でレポーター遺伝子の発現が検出できず、プロモーターレポーター株作製に変更したことによっても、実験の進行に遅れが生じた。RNAシークエンスの解析を進めているが、下流候補遺伝子の絞り込みに苦労していることも進行に遅れが生じている。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、変異株作製による機能解析については、これまでにCRISPR-Cas9系を用いたゲノム編集株作製法応用し、既知の胞子体分裂組織に関わる因子の変異株背景でPpNLPaを破壊しており、遺伝学的経路の解明を進めている。また、既に取得済みの細胞分裂に関わる遺伝子のプロモーターレポーターラインを利用し、NLPaの機能と細胞分裂活性との関係について調べてきた。細胞分裂マーカーがGUSレポーターのみであったので、新たにYFPレポーターを融合した細胞分裂マーカー株を取得したため、同様の解析を進め、2倍体メリステムの発生における、PpNLPaと細胞分裂の関係をさらに詳細に調べていく予定である。被子植物のNLPの機能から推察される、硝酸応答性の有無についても、RNAシークエンスの結果から推測される下流候補遺伝子のシス配列を調べることにより解明を進めている。NLPaが制御する発現制御する遺伝子の網羅的な同定に関して、野生型、PpNLPa-機能抑制株、PpNLPa-YFP過剰発現株、の3者でRNAシークエンス解析を実施しデータを既に取得している。
今年度はこれらのデータをまとめてヒメツリガネゴケの2倍体メリステムの維持制御についての成果発表をする予定である。
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| Causes of Carryover |
令和2,3年度の緊急事態宣言発令に伴い全体的に実験の開始に遅れが生じ、申請時には初年度に予定していたRNAシークエンス解析の実施が令和4年度にずれ込んだ。また、令和3年度後半から令和4年度にかけて産休育休の取得により研究を約6ヶ月間中断した。令和4年度の使用額の大半は、申請時には令和3年度に予定していたRNAシークエンスの結果から得られる、PpNLPaの下流候補遺伝子の機能解析のための変異株作製のための実験消耗品等に使用したため、令和4年度の未使用額が生じた。研究成果発表の予定が遅れており、次年度は研究成果発表等に使用したい。
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