2020 Fiscal Year Research-status Report
RAB23が関わる植物精子の運動装置形成機構の解明
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20K15824
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| Research Institution | National Institute for Basic Biology |
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Principal Investigator |
南野 尚紀 基礎生物学研究所, 細胞動態研究部門, 特任助教 (20823256)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 膜交通 / RAB GTPase / 精子 / 鞭毛 / ゼニゴケ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
陸上植物の一部の系統では運動能をもつ雄性配偶子である精子を形成する．鞭毛と多層構造体は植物精子の運動能発現のための必須の細胞構造であるが，その構築メカニズムについては未解明な点が多い．RAB23は膜交通因子であるRAB GTPaseのひとつであり，鞭毛・繊毛をもつ真核生物によく保存されている．これまでに，ゼニゴケrab23変異体では運動装置の構造の異常が見いだされていることから，RAB23が植物精子の運動装置の正常な形成に重要な因子であると考えられる．そこで本研究では，ゼニゴケRAB23の詳細な分子機能の解明を通して，植物精子の鞭毛と多層構造体の構築システムの一端を明らかにすることを目指している．
20年度は微小管および軸糸成分のマーカーラインの局在解析およびタグ付きゼニゴケRAB23の局在解析を精力的に行った．微小管および軸糸成分の局在そのものに目立った異常は見られなかったが，鞭毛が正常に形成できず精子細胞体内に異常な繊維状の構造として蓄積することを見出した．また，ゼニゴケRAB23が鞭毛形成の初期において活性化状態の時に鞭毛へと局在することを見出した．さらにゼニゴケRAB23の鞭毛への局在にはC末端側の脂質修飾が重要であることを示唆する結果を得た．
また，RAB23と協調的に機能する因子を明らかにするため，タグ融合ゼニゴケRAB23の共免疫沈降産物について質量分析を行った．その結果，ゼニゴケRAB23の相互作用因子の候補をいくつか選抜することができた．現在選抜した候補因子について，ゼニゴケRAB23の相互作用の更なる検証と機能解析を行うための準備を進めている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
微小管および軸糸構成成分のマーカーラインの局在観察により，変異体では鞭毛が正常に形成できず精子細胞体内に異常な繊維状の構造として蓄積するという異常を見出すことができた．またゼニゴケRAB23は形成中の鞭毛に局在し，その局在化には活性化状態や脂質修飾が重要であることも見出すことができた．一方で，ゼニゴケrab23変異体でみられる運動装置の異常を引き起こす直接的な原因について，質量分析による網羅的な解析により野生型と変異体の精子タンパク質の比較を行いそれを担う因子を同定することを試みたが，サンプル量が少ないためか有望な候補因子の選抜には現在まで至っていない．
ゼニゴケRAB23と協調的に機能する因子の同定については，タグ付きゼニゴケRAB23の共免疫沈降産物について質量分析を行い，ゼニゴケRAB23の相互作用因子の候補をいくつか選抜することができたため，こちらは予定通りに進展していると考えている．
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度はサンプル量が少なく不十分な結果に終わった野生型と変異体の精子タンパク質の網羅的な解析を再び行う．最近ゼニゴケの造精器を簡便にサンプリングする方法を発見し，サンプル量の問題を解決できるのではないかと考えている．得られた候補因子については，タグ融合タンパク質を発現させその細胞内局在を調べる．
ゼニゴケRAB23と協調的にはたらく分子の解析については，まずこれまでに選抜した候補因子とゼニゴケRAB23の相互作用をプルダウン法などにより検証する．ゲノム編集により候補因子の遺伝子破壊株を作出し，精子形成において起こる異常についても調べる．さらに遺伝子破壊株においてゼニゴケRAB23の細胞内局在に異常が見られないかを調べる．候補因子の細胞内局在についても観察を行うとともに，それらの局在がゼニゴケrab23変異体において変化が見られるかを調べる．以上の解析から得られた知見を統合し，RAB23が関わる植物精子の運動装置形成機構のモデルを構築する．
また上記モデルの普遍性を検証するためにクラミドモナスを用いた解析も行う．クラミドモナスRAB23について，変異体の表現型解析や細胞内局在解析を進める．またゼニゴケの解析から得られた相互作用因子についても，クラミドモナスにホモログが存在するものについては遺伝子破壊株の影響や細胞内局在の解析を行う．
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| Causes of Carryover |
野生型とゼニゴケrab23変異体の精子タンパク質の網羅的解析の進展が遅れたため，それに関わる経費が次年度使用額となった．またCOVID-19の影響により，研究打ち合わせや研究発表に関わる旅費経費を執行しなかったため，それらが次年度使用額となった．21年度は，サンプル量の問題を解決できる見通しがたったため，質量分析による網羅的な解析を再び行う．この解析および共免疫沈降産物の質量分析により得られたゼニゴケRAB23の機能関連因子について，分子遺伝学的解析および生化学的解析を行う．これらの解析のために助成金の多くを執行する予定である．
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