2021 Fiscal Year Research-status Report
ノックイン法によるミツバチのキノコ体細胞タイプ特異的な遺伝子操作の実現と機能解明
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20K15839
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
河野 大輝 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (60846773)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | セイヨウミツバチ / 社会性行動 / キノコ体 / ケニヨン細胞 / ノックイン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高度な社会性行動を示すセイヨウミツバチでは、昆虫脳の高次中枢であるキノコ体の行動制御における機能に着目した研究が進んでいる。ミツバチのキノコ体を構成するケニヨン細胞には、異なる遺伝子が発現する複数のサブタイプが存在しており、各サブタイプが異なる脳機能に関わる可能性が示唆されている。また、ハチ目昆虫におけるサブタイプ数の種間比較により、ハチ目の行動進化においてサブタイプ数の増加が重要であった可能性が示唆されている。しかし、ミツバチにおいて有効な遺伝子操作法が近年まで存在しなかったことから、各サブタイプの機能は遺伝子発現解析による推察に留まっている。本研究では、ミツバチにおける細胞種特異的な遺伝子制御法を確立と、これを利用した各サブタイプの機能解明を目的とする。
今年度は、まずミツバチの各ケニヨン細胞サブタイプの生理的特性の解析として、各サブタイプの網羅的遺伝子発現プロファイルを同定した。当初はFACSによる細胞分離とRNA-seqを行う計画だったが、ミツバチのキノコ体のシングルセルRNA-seq解析に変更し、各分業を担う働き蜂（育児蜂、採餌蜂）と女王蜂のケニヨン細胞の網羅的な遺伝子発現プロファイルを取得できた。
ノックインについては、キャピラリーの刺入部位やインジェクションする授精卵の産卵後の時間などのインジェクション条件を検討し、ノックインが生じた際に増幅されるPCRバンドが比較的高い割合で検出される条件を決定した。一方で、この条件でもF0世代ではドナーDNA由来のタンパク質は検出されなかった。そこで、現在はインジェクション個体を女王蜂に分化させてF1世代を産卵させる計画に変更し、ノックイン手法の確立を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初は、ノックイン手法を確立した後に各サブタイプ選択的に蛍光タンパク質を発現させ、蛍光タンパク質発現細胞をFACSにより分離した後、RNA-seq解析を行うことで、各サブタイプの網羅的遺伝子発現プロファイルを同定する計画だった。多大な労力を要する実験を想定していたが、「先進ゲノム支援」によるご支援を賜ることができ、ミツバチのキノコ体のシングルセルRNA-seq解析に変更した。育児蜂、採餌蜂各2サンプルと、女王蜂1サンプルを用いた解析により、カースト毎および働き蜂の分業毎のケニヨン細胞の遺伝子発現プロファイルを取得できた。また、シングルセルRNA-seqデータの解析によって同定された各サブタイプのマーカー遺伝子について、実際のキノコ体における発現解析を行い、新たなサブタイプマーカー遺伝子を複数同定した。
ノックインについては、まだタンパク質の発現までは検出できておらず、実用化には到っていない。今年度はノックイン効率の向上を目的とした条件検討により、インジェクション条件を決定した。また生殖細胞系列に目的のノックインが生じている個体をスクリーニングする計画に変更し、このための産卵ケージを作成した。
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| Strategy for Future Research Activity |
決定したインジェクション条件で受精卵にノックイン処理を施し、孵化した幼虫を女王蜂に分化させる。この際、無女王蜂群に王台に入れて導入し、働き蜂によって女王蜂に分化させる方法と、人工飼育によって女王蜂化させる手法の両方を試みる。作出した女王蜂を産卵用ケージに導入し、未受精卵（F1世代）を産卵させ、孵化した幼虫においてノックインが生じているかを、シーケンス解析とタンパク質発現解析により調べる。ドナーDNA由来のタンパク質発現を確認できれば、各サブタイプ選択的に外来遺伝子を発現させるノックインを同様に行い、F1世代の働き蜂を作出することを目指す。
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| Causes of Carryover |
シングルセルRNA-seq解析費用が先進ゲノム支援の予算内で全て収まり、追加支出が生じなかったため。これらは産卵用ケージの作出費用と、冬に群を維持するために必要な蜂群の購入費に充てる。
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