2021 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of mechanisms for photoperiod-dependent regulation of reproduction by photoperiodic clock
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20K15842
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
長谷部 政治 大阪大学, 理学研究科, 助教 (40802822)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 光周性 / 概日時計 / 神経分泌細胞 / 電気生理学 / RNA干渉法 / 免疫組織化学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ホソヘリカメムシを用いて、概日時計による光周期に応じた生殖機能制御の神経機構の解析を引き続き実施した。本年度において、時計細胞から生殖機能制御までの光周期情報の伝達機構を明らかにするために、脳内のシナプス伝達で広く用いられる神経伝達物質：グルタミン酸に着目した解析を行った。脳の培養実験によりグルタミン酸放出量を測定したところ、長日条件と比べて短日条件で飼育したメスのカメムシの脳の方が、グルタミン酸レベルが高いことが分かった。更に、RNA干渉法により時計遺伝子periodをノックダウンしたところ、このグルタミン酸レベルの日長依存的な変化が見られなくなることが分かった。
続いて、このグルタミン酸レベルの日長依存的な変化が、生殖機能の光周性応答に関与しているかを調べた。RNA干渉法によりグルタミン酸関連酵素の遺伝子ノックダウンしたところ、グルタミン酸レベルの日長依存的な変化が消失した。これらのノックダウン個体において、卵巣発達・産卵や産卵促進に寄与する脳間部（pars intercerebralis, PI)細胞の神経活動の光周性反応を調べたところ、いずれの光周性も消失していることが分かった。
最後にグルタミン酸によるPI細胞の神経活動への直接的な影響を解析した。薬理学的な投与実験の結果、グルタミン酸はPI細胞の神経活動を強く抑制する作用を持つことが分かった。また、Single cell PCRの結果、PI細胞には抑制性のグルタミン酸受容体のglutamate-gated chloride channel（GluCl）が発現していることが分かった。
これらの解析結果から、時計遺伝子依存的に全脳レベルでのグルタミン酸ダイナミクスが光周期に応じて変化し、産卵促進に寄与するPI細胞の制御などを介して生殖機能の光周性制御を行っていることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
概日時計細胞から生殖制御に関与する神経細胞群への光周期情報の神経伝達として、本年度は脳内で広く使われるグルタミン酸に着目した解析を行った。解析の結果、全脳レベルでのグルタミン酸ダイナミクスが光周期に応じて変化し、それが概日時計遺伝子period依存的であることが分かった。更に、RNA干渉法を用いたグルタミン酸ダイナミクスの遺伝的操作によって、生殖機能やPI神経活動で見られる光周性反応が消失することも明らかにした。また、グルタミン酸はPI細胞の神経活動をGluClを介して直接的に抑制する作用をもつことも示唆された。
これらの研究成果は、ホソヘリカメムシにおいて概日時計は、脳内のグルタミン酸ダイナミクスを光周期に応じて変化させることによって、生殖機能の光周性制御を行っていることを示唆するものであり、概日時計に基づいた生殖の光周性制御機構の解明に大きく貢献するものである。このような、全脳レベルでの神経伝達物質のダイナミクスの変化が、光周性に重要であることを示した研究はほとんどなく、本年度の研究成果は脳内の光周性神経制御に関する新たな知見をもたらすものであると考えられる。
以上のことから、光周時計による日長依存的な生殖制御機構の解明に向けて、順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の研究成果により、概日時計遺伝子periodに基づいて脳内グルタミン酸ダイナミクスが日長変化し、生殖の光周性制御に重要であることが示唆された。ホソヘリカメムシの脳内には複数の領域に時計タンパク質PERIOD発現細胞が局在していることが報告されている。昨年度までの解析により、脳内の一部のPERIOD発現細胞のPERIOD発現強度が光周期に応じて変化することが分かっており、このPERIOD発現の日長変化が光周性反応に関与している可能性が考えられる。
そこで、最終年度の次年度において、PERIOD発現の光周性制御の分子基盤とその生理的重要性について解析を行う。他種で時計タンパク質の安定性や分解に関与することが報告されている遺伝子に注目し、RNAシーケンスのデータベース上からホソヘリカメムシにおける相同遺伝子群を探索する。その後、RNA干渉法による遺伝子ノックダウンを行い、PERIOD発現への影響を調べるとともに、生殖機能や脳内のグルタミン酸ダイナミクス・PI細胞の活動性の光周性への影響も解析する。
また、ホソヘリカメムシにおいてはPI細胞群の他に、脳側方部(pars lateralis, PL)細胞群が生殖機能の光周性制御に関与していることが報告されている。このPL神経細胞群からの神経活動解析も引き続き取り組んでいく。
これらの解析を通じて、概日時計を基盤とした生殖の光周性制御機構の実体の解明に近づきたい。
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