2021 Fiscal Year Research-status Report
ヒトの強靭な皮膚はどうやってできてきた？ヒトの皮膚を形成した塩基置換の同定
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20K15851
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| Research Institution | The Graduate University for Advanced Studies |
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Principal Investigator |
荒川 那海 総合研究大学院大学, 先導科学研究科, 特別研究員 (90844754)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ヒト特異的皮膚形質 / 遺伝子発現量 / プロモーターアッセイ / ゲノム編集 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ヒトの皮膚は他の霊長類に比べ多くの形態的・生理学的特徴があるが、それらがどのように進化してきたのか、その遺伝的基盤はあまり明らかになっていない。これまでの研究で私は、発現量解析によりヒト特異的皮膚形質に繋がる可能性のある4遺伝子の発現量増加をヒトの皮膚で検出した。さらにこれらのヒト特異的遺伝子発現を生み出すヒト系統での塩基置換を推定した。本研究課題では、それらの置換が実際にヒト特異的遺伝子発現を生み出しているのかを、ヒト皮膚培養細胞を用いたプロモーターアッセイとゲノム編集により解明することを目的としている。
今年度はまず、昨年度までに作成したプロモーターアッセイ用のベクターの改良を行った。ベクター上のルシフェラーゼ遺伝子とその上流の転写活性を調べるヒトゲノム領域の配列の間に、ヒト特異的発現を示した各遺伝子のプロモーター領域を挿入した。このプロモーター領域はエピジェネティックな情報から推測されているものを用いた。これらのベクターを皮膚培養細胞に導入する際にはエンドトキシンなどの細胞毒性を示す物質を取り除いておく必要がある。そこでベクターのクローニング後はエンドトキシンを取り除く工程を取り入れたプラスミドDNA精製を行った。これらのベクターをヒト皮膚培養細胞に導入し、ルシフェラーゼ遺伝子の発現量の比較を行ってきた。その結果を踏まえて、より信頼性のある測定値を得るためにアッセイ系の改良を行った。
また、予備実験としてゲノム編集を行った細胞株を作成中であり、プロモーターアッセイで絞り込んだ候補置換について培養細胞での発現比較を行う準備を進めた。これにより、プロモーターアッセイで特定した塩基置換が、ゲノム中の他の遺伝子ではなくヒト特異的発現を示した遺伝子の発現を変化させるものであるかを検証することができる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今年度は昨年度までに作成したプロモーターアッセイに必要な各種ベクターの改良を行った。また、ベクターの精製方法を見直し、エンドトキシンを取り除く工程を取り入れたプラスミドDNA精製を行った。これらのベクターをヒト皮膚培養細胞に導入し実際にアッセイを行い、より信頼性のある測定値を得るために手法の改良を行ってきた。ルシフェラーゼによる化学発光を測定するプロモーターアッセイでは、安定した測定結果を得ることのできる実験系の構築が重要である。手法の改良を行ったことにより来年度から行うアッセイをより安定性のある測定にできると考えている。
また、予備実験としてゲノム編集を行った細胞株を作成中であり、プロモーターアッセイで絞り込んだ候補置換について培養細胞での発現比較を行う準備を進めた。これにより、プロモーターアッセイで特定した塩基置換が、ゲノム中の他の遺伝子ではなくヒト特異的発現を示した遺伝子の発現を変化させるものであるかを検証することができる。来年度はこれまでに合成したsgRNAを実際に皮膚培養細胞に導入し、ゲノム編集を行った細胞株を作成する計画である。
上記のように、皮膚でのヒト特異的遺伝子発現を生み出す塩基置換の特定に向けて実験を進めている。実験手法の改良や予備実験などを踏まえて安定した実験系の構築を行うことで、今後信頼性のある測定データを得ることができる。以上のことからおおむね順調に研究課題が進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
プロモーターアッセイについては、改良したベクターを用いて引き続きアッセイを行っていく。挿入したヒトゲノム領域の配列に転写活性が確認されたら、Mutagenesisにより領域中の候補塩基置換サイトのみをヒト型から類人猿型の塩基に置換したベクターを作成する。これらのベクターをヒト皮膚培養細胞に導入し、ヒト型と類人猿型の塩基を持つベクター間のルシフェラーゼ遺伝子の発現量を比較していく。このアッセイで発現量差が検出できたならば、ベクターに挿入する配列を類人猿の同領域配列、候補塩基置換サイトのみをヒト型にしたアッセイも行い、その置換が発現量変化に関わっているのかを明らかにする。
また、予備実験として引き続きゲノム編集を行った細胞株の作成を行う。来年度は、すでに合成したsgRNAなどを実際にヒト皮膚培養細胞に導入し、核ゲノムの候補置換サイトのみをヒト型から類人猿型に書き換え、ゲノム編集の実験系を構築する計画である。実験系が構築できたら、実際にプロモーターアッセイで発現量差を示した候補置換サイトをヒト型から類人猿型に書き換えた細胞株を作成する。ヒト型と類人猿型の塩基を持つ細胞間で、ヒト特異的発現を示した遺伝子の発現を定量PCRによって比較する。これにより、プロモーターアッセイで特定した塩基置換が、ゲノム中の他の遺伝子ではなくヒト特異的発現を示した遺伝子の発現を変化させるものであるかを検証することができる。
プロモーターアッセイとゲノム編集での発現比較を行うことで、着目する遺伝子のヒト特異的発現を生み出す塩基置換を特定していく。これにより、ヒト特異的皮膚形質が進化の過程でどのような遺伝的基盤によって獲得されてきたのかを明らかにできると考えている。
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| Causes of Carryover |
今年は新型コロナ感染症拡大防止のために国際学会などに参加ができず、旅費・参加費などの支払いがなく、次年度への繰越し金が多くなった。次年度はプロモーター アッセイ、ゲノム編集をたくさん行うため、繰越し金も含めて予算を多く支出する計画である。
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