TDP-43の機能異常に着目した運動ニューロン保護機構の解明とALS治療戦略

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K15904
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 長谷川 実奈美 東京慈恵会医科大学, 医学部, 助教 (00778764)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: ALS / TDP-43 / スプライスバリアント

Outline of Annual Research Achievements

本研究はALSの新規治療戦略の考案を目指し、その病因タンパク質TDP-43の機能、特にスプライシング自己制御機構に着眼した。TDP-43は自身のスプライシングを制御することで機能的バリアントの比率を一定に保つことが知られている。また、面白いことに、マウスではTDP-43スプライスバリアントの半分以上が機能的バリアントであるものの、ヒトにおいてはわずか10%にも満たないことが示されている。つまり、ヒトでは9割以上が機能的バリアント以外のスプライスバリアントであるにも関わらず、これらのスプライスバリアントについては未だ不明な点が多い。これまでの本研究成果より、これらスプライスバリアントの一つ(TDPsv)が翻訳されALS患者脊髄切片の運動ニューロンで有意に局在パターン変化を引き起こしていること、およびTDPsvがドミナントネガティブにTDP-43のスプライシング機能を阻害することを見出している。そこで、本計画ではTDPsvについて翻訳産物の機能および細胞内動態の解析、運動ニューロン恒常性維持への影響について検証した。
TDP-43スプライシング機能の発現には機能的バリアントである全長TDP-43のホモダイマー形成が必須であることが示されている。そこで2021年度は、TDPsvと全長TDP-43との複合体形成の有無、およびTDP-43スプライシング機能への影響について検証した。培養細胞にTDPsvと全長TDP-43を共発現させ、免疫沈降法により両者が複合体を形成することを確認した。さらに、TDPsvに変異を導入し全長TDP-43との複合体形成を阻害すると、TDPsvによるドミナントネガティブ活性が打ち消されることがわかった。よって、TDPsvは全長TDP-43のホモダイマー形成を競合的に阻害することでTDP-43のスプライシング機能阻害を引き起こすことが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究において、TDPsvが機能的バリアント全長TDP-43に対してドミナントネガティブ活性を示すという知見は以前から得ていたもののその分子生物学的メカニズムは不明であったが、2021年度の本研究成果によりTDPsvが全長TDP-43との複合体形成依存的にドミナントネガティブ活性を示すことがわかった。過去の他グループの研究報告より、ALS患者の脳組織においてTDP-43のスプライシング機能低下が引き起こされていることが示されており、運動ニューロン死までの過程にはTDP-43の機能低下が関与する可能性は高いと考えられる。TDPsvによるドミナントネガティブ活性はこの過程の一端を担う可能性があり、2020年度の本研究成果であるTDPsvが細胞毒性を示すという知見もこれを支持する結果であると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

今後はTDPsvの全長TDP-43に対するドミナントネガティブ活性とTDPsvによる細胞毒性の関連を検証する為、TDPsvと全長TDP-43の複合体形成を阻害した場合にTDPsvによる細胞毒性が抑制するかどうかヒトiPS細胞より分化させたニューロンにて検討を行う。また、TDPsvへのスプライシングを促進する複数の因子についても新たな知見を得ている為、TDPsvへのスプライシングが促進されるメカニズムについても検証を行う。この複数の因子について、TDPsvスプライシングへの影響の有無を検討する。影響が見られたものについてはその作用点と考えられる箇所に変異を導入したコンストラクトを作製しその影響が打ち消されるか検証する。複数の因子がTDPsvのスプライシングに影響した場合、これらに相乗効果および相殺効果があるかについても検証する。

Causes of Carryover

2022年度も引き続きiPS細胞より分化誘導したニューロンを用いた実験などの高価な試薬を使用する実験を多く予定しており、その経費が必要である。また、論文投稿および学会において成果発表を予定している為、一部の直接経費を次年度の経費とした。