2021 Fiscal Year Research-status Report
Morphological and functional analysis of pretectal neural circuit by labeling and single cell RNA-sequencing of visually responsive cells
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20K15906
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| Research Institution | National Institute of Genetics |
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Principal Investigator |
松田 光司 国立遺伝学研究所, 新分野創造センター, 特任研究員 (40845228)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ゼブラフィッシュ / 前視蓋神経回路 / 刺激特異的細胞標識 / 1細胞RNA-seq / 形態・機能解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、視覚刺激に反応する前視蓋ニューロンを特異的に標識し、シングルセル遺伝子発現解析を行う。神経活動と遺伝子発現プロファイルから前視蓋ニューロンを分類し、その細胞形態の解析及び行動との機能的因果関係の検証を目指す。2020年度では、樹立したTg(elavl3:nlsCaMPARI2)系統を用い、オプティックフロー視覚刺激(Moving条件)に対して反応する神経細胞群を赤色蛍光標識し、FACSにより単離した。その後、10x Genomics社Chromiumシングルセル遺伝子発現プラットフォームにより、1細胞RNA-seq解析を行った(国立遺伝学研究所・先端ゲノミクス推進センターとの共同研究）。
本年度は、オプティックフロー視覚刺激に反応した前視蓋ニューロンのマーカー遺伝子の特定を目指し、バイオインフォマティクス情報解析を実施した。Cell Ranger (10x Genomics社)やRパッケージ Seuratを用いて、オプティックフロー視覚刺激反応性ニューロンについてクラスタリングを行い、各クラスターに特徴的に発現している遺伝子を探索した。その結果、間脳、終脳、視蓋、後脳、手綱核、小脳、運動ニューロンといった複数の異なる細胞集団を特定することに成功した。次に、前視蓋ニューロンが含まれると考えられる間脳クラスターに着目し、候補遺伝子を選択した。これらの遺伝子座にCRSIPR/Cas9ゲノム編集技術を利用しGal4をノックインすることで、新規Gal4系統を樹立した。また、前視蓋ニューロンを含むクラスターを絞り込むため、静止したまま動かない縞模様を提示した場合(Stationary条件)に標識される細胞について、1細胞RNA-seq解析を実施した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
オプティックフロー視覚刺激に反応するニューロンについて、1細胞RNA-seq解析を実施し、複数の異なる細胞集団を特定した。シーケンスデータのマッピング、発現カウントではCell Rangerを利用し、その後の品質管理やクラスタリング等はSeuratを利用した。間脳クラスターに注目して候補遺伝子を選択し、新規Gal4系統の樹立に成功している。一方で、前視蓋ニューロンは中脳・間脳のクラスターに含まれると考えられるが、小脳や手綱核のような明確な区別ができず、クラスター特定には至っていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
前視蓋ニューロンクラスターを特定するため、静止したまま動かない縞模様を提示した場合(Stationary条件)に標識される細胞について1細胞RNA-seq解析を実施し、本年度で得たオプティックフロー視覚刺激(Moving条件)反応性細胞の解析結果と比較する。Moving条件下で出現し、Stationary条件下では出現しないクラスターが、候補遺伝子探索に重要なクラスターであると考えられる。候補遺伝子については、CRSIPR/Cas9ゲノム編集技術により新規Gal4系統を樹立し、カルシウムイメージングを用いて、オプティックフロー視覚刺激に対する神経活動解析を実施する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染拡大の影響を受け、出張予定であった研究会がオンライン開催となり、当初計上していた旅費が不要となったため。未使用額に関しては、次年度の物品費及び出張旅費等に充てる。
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