多剤排出ポンプの隠された役割：その未知の基質の同定による役割の解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K15994
• Research Institution: Hiroshima University
• Principal Investigator: 森田 大地 広島大学, 医系科学研究科(薬), 助教 (80826371)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 多剤排出ポンプ / 反転膜小胞 / 薬剤排出

Outline of Annual Research Achievements

黄色ブドウ球菌の主要な多剤排出ポンプNorAの基質輸送を利用した基質の分離・濃縮を目指し、NorAを大腸菌に発現させ、反転膜小胞を調製し、検出方法の条件を検討した。
NorA反転膜に対し、黄色ブドウ球菌の培養上清の濃縮液を添加すると輸送活性が見られたが、解析対象のNorAを欠損した黄色ブドウ球菌の培養上清の濃縮液でも輸送活性が確認された。これによってNorA以外の大腸菌の輸送タンパクによる輸送も行われていることが示唆されたため、より直接的に輸送された物質の解析が必要であった。このためHPLCを使用して、反転膜中に濃縮された物資の解析を行うための条件検討を行った。
NorAの既知の良い基質であるnorfloxacinを対象として、反転膜に濃縮後、抽出を行いHPLCでの検出に成功した。これによってHPLCを用いた反転膜への基質濃縮の解析が可能であると考えられた。適切な回収条件を検討するため使用する反転膜の濃度等に関する条件検討を実施中であり、適切な条件を設定後、培養上清を用いて反転膜内に濃縮された物質の探索を計画している。
また、NorA欠損黄色ブドウ球菌および過剰発現黄色ブドウ球菌を用いた培養上清中の物質の差異によって輸送される基質の探索を解析することも計画している。この解析を行うため、メタボローム解析による培養上清の網羅的解析について検討を行った。類似した実験が大腸菌において行われており、実験条件および解析を実施可能な機関について検討を行ない、翌年度の実施を計画している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

反転膜小胞中の物質の直接的な測定のためのHPLCの有効性について検討ができたため、反転膜内に濃縮された培養上清中の物質の探索の実施を行うことが可能である。
また、培養上清中の物質のメタボローム解析についても検討を終え、NorA欠損および過剰発現株での差異解析を翌年度の早い段階で実施を計画している。

Strategy for Future Research Activity

培養上清中のNorA基質を反転膜に濃縮しHPLCで解析し、NorA反転膜で特異的に濃縮された物質についてより詳細な解析を行い、その物質単独での輸送を解析することでNorAの輸送基質であることを確認する。
また培養上清のメタボローム解析によりNorA過剰発現株で特異的に多い物質についても、その物質単独での輸送を解析することでNorAの輸送基質であることを確認する。
NorA反転膜で輸送基質の確認ができた場合は、その他の黄色ブドウ球菌の多剤排出ポンプの基質探索も実施する予定である。

Causes of Carryover

多剤排出ポンプの基質の網羅的探索のため、細胞内容物のメタボローム解析を計画している。2021年度実施予定であったメタボローム解析に関して、培養条件や委託業者の選定によって予定が遅延し本年度中の実施ができなかったため、2022年度にメタボローム解析を実施するための費用として次年度使用額が発生した。この費用について2022年度前半にはメタボローム解析のために使用する予定である。