2021 Fiscal Year Research-status Report
KOマウスを用いたミトコンドリア鞘形成メカニズムの解析
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20K16107
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
嶋田 圭祐 大阪大学, 微生物病研究所, 助教 (60779601)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 精子ミトコンドリア / 精子形成 / 液-液相分離 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究ではSmdr3及びSmdr5遺伝子を欠損させたKOマウスの表現型を解析し，これら遺伝子がどのようにミトコンドリア鞘形成に関与しているのかを明らかにすることを目的としている。
SMDR3に対する抗体を作成し，免疫電子顕微鏡観察をしたところ，SMDR3は予想に反してミトコンドリアとは独立した2種類のnuageに局在していることが明らかになった。このnuageはpiRNAが局在するIntermitochondrial cementとは異なるnuageであり，これまでにその機能については全く解析されてこなかったものであった。本研究によりSMDR3に由来するnuageが精子ミトコンドリアの整列に関連することが明らかになった。SMDR3を培養細胞に過剰発現させると，SMDR3は単独で細胞質内にdropletを形成することから，SMDR3は細胞内に液-液相分離を引き起こすことで機能していることも明らかになった。
Smdr5 KOマウスは精子形成過程で精子ミトコンドリアの内部構造に異常を呈し，ミトコンドリア鞘形成がうまくいかないことで雄性不妊となる。今回Smdr5を生殖細胞のみで発現するトランスジェニック（Tg）マウスを作成し、Smdr5 KOマウスに導入すると、雄性不妊がレスキューできることが明らかになった。さらにユビキタスに発現するSmdr5のファミリー遺伝子についても、生殖細胞のみで発現するTgマウスを作成し、Smdr5 KOマウスに導入しても雄性不妊はレスキューできたため，SMDR5の機能はそのファミリータンパク質と同様の働きを有していることが考えられた。したがって，これら2つのタンパク質は発現場所のみ違いがあるものの，機能は同じタンパク質であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
SMDR3は精子ミトコンドリア異常により雄性不妊となることから，ミトコンドリアに局在するタンパク質であると考えていたが，実際には生殖細胞の一時期のみに存在し，ミトコンドリアとは独立する2種類のnuageに局在することが分かった。これは精子ミトコンドリアの形態に全く関係ないと思われていたnuageが、ミトコンドリア鞘形成に必須であることを示しており，研究開始当初からは全く想像のできない結果であった。さらにこのnuageは培養細胞にSMDR3を発現させることでも誘導することができ，SMDR3をリン酸化酵素と同時に発現させるとnuageの誘導はなく，脱リン酸化酵素と同時に発現させると誘導できることなども分かっており，新たなnuage研究への応用も感じさせるものだった。
さらに精子ミトコンドリアに異常を呈するGm9999 KOマウスの解析により，この遺伝子から誘導される2種類のポリペプチドはそれぞれ精子ミトコンドリア鞘形成期の異なる時期に発現して，精子ミトコンドリアの鞭毛への巻き付きに関与していることを明らかにした。この研究は論文として報告をおこなった（Mise, S., Matsumoto, A., Shimada, K., et al., (2022) Kastor and Polluks polypeptides encoded by a single gene locus cooperatively regulate VDAC and spermatogenesis, Nat Commun. 13, 1071.）。
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| Strategy for Future Research Activity |
SMDR3に関しては、SMDR3によって誘導されるnuageの機能についての解析を進める。nuageは電子顕微鏡で観察すると電子密度が高いことから，核酸が多く含まれていることが考えられる。そこでRNA免疫沈降法により，抗SMDR3抗体による免疫沈降複合体からRNAを抽出して，そこにRNAが含まれているかRNA-seqなどを用いて解析する。可能であればどのようなRNAが含まれているのかを明らかにし，どのようにしてミトコンドリアの局在に影響を与えているのかを考察する。
SMDR5については，SMDR5と特異的に反応する抗体を作製できていないため，その局在についてトランスジェニックマウスを活用して明らかにする。蛍光顕微鏡観察から精子ミトコンドリアに局在していることは分かっているが，さらにミトコンドリア内のどこに局在し，どのような過程を経て精子ミトコンドリアの内部構造の変化を引き起こしているのかを，免疫電子顕微鏡法により詳細に明らかにする。
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| Causes of Carryover |
SMDR3の局在がnuageに局在するという発見により，in vitro解析を中心に新たな研究を模索する必要性が出てきた。液-液相分離に関連する実験やRNAの検出など新たな実験系を構築しなくてはならなくなったので，そのための期間を設けて次年度に実験をおこなう必要性が出てきた。
主にRNA-seqなどの核酸実験を中心に繰越金を使用する予定である。
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