インフルエンザRNAポリメラーゼとウイルス増殖阻害抗体のクライオ電子顕微鏡解析

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K16264
• Research Institution: University of Tsukuba
• Principal Investigator: 吉田 尚史 筑波大学, 生存ダイナミクス研究センター, 助教 (90724774)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: インフルエンザ / RNAポリメラーゼ / 増殖阻害抗体 / クライオ電子顕微鏡

Outline of Annual Research Achievements

現在コロナウイルスの世界的な大流行が大きな問題となっているかが、今後新型インフルエンザウイルスによるパンデミックが危惧されている。インフルエンザウイルスは頻繁に変異を起こし、タミフルなどの既存薬に対して耐性をもつことが大きな問題となっている。インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼは、ウイルス増殖の中止的な役割を担っており、他のウイルスタンパク質と比べて極端に変異が起こりにくいことから、薬剤ターゲットして注目されてきた。これまで、インフルエンザRNAポリメラーゼのPAサブユニットに特異的に結合し、細胞内でウイルス増殖を阻害するモノクローナル抗体の開発に成功した。本研究では、増殖阻害抗体がインフルエンザRNAポリメラーゼにどのように結合し、ウイルス増殖を抑制しているか、その詳細な分子機構を明らかにするために、クライオ電子顕微鏡顕微鏡を用いた単粒子解析によって複合体構造の解析を行なっていく。
これまでに、インフルエンザRNAポリメラーゼと阻害抗体の複合体試料を調製し、クライオ電子顕微鏡による単粒子解析を試みた。その結果、低分解能ではあるものの複合体構造の解析に成功し、阻害抗体の結合部位を同定することができた。さらなる高分解能での構造解析を目指し、試料調製および立体構造解析を進めていく。また、等温滴定型カロリーメータ（ITC）や分析超遠心（AUC） を用いて、阻害抗体とインフルエンザRNAポリメラーゼの相互作用について解析を進めていく。上記の実験を行うためには、大量のタンパク質試料が必要となるため、インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼ全体およびPAサブユニットの大量発現系を構築し、各タンパク質について調製方法の確立を目指した。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

所属先の変更に伴い、実験環境の整備を行なったため、当初の予定よりも研究がやや遅れが生じた。そのため、本研究で目的としているインフルエンザRNAポリメラーゼ全体と阻害抗体の構造解析を進めることができなかった。一方で、インフルエンザRNAポリメラーゼのPAサブユニットについては、大腸菌を用いたタンパク質発現によって試料調製を行なった。PAサブユニットと増殖阻害抗体の相互作用をITCを用いて解析を行い、解離定数を決定することができた。

Strategy for Future Research Activity

新しい所属先においても、昆虫細胞バキュロウイルス発現システムの実験系を立ち上げ、目的としているタンパク質を発現させることが可能となっている。また、2021年度に所属先の研究センターに最先端のクライオ電子顕微鏡が導入された。そのため、今後は当初予定していたクライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析を進め、高分解能での立体構造解析を行なっていく予定である。また、ウイルス増殖阻害の詳しいメカニズムを解明するために、変異体タンパク質の作製やITCを用いた相互作用解析を実施していく予定である。

Causes of Carryover

2021年度に所属先の変更に伴い実験環境が大きく変わったことから、当初の予定通りに研究を進めことができなかった。そのため、補助事業の期間延長を申請した。2022年度は当初予定していた通り、タンパク質の発現を行い立体構造解析や相互作用解析を実施していく予定であり、そのための消耗品（タンパク質 精製用試薬、タンパク質結晶化用試薬、ガラス・プラスチック消耗品)を購入する予定である。また、本研究では、タンパク質とRNAの相互作用解析を行う予定であり、そのRNAは主に30塩基以下のものであり、化学合成が安価で効率的なため、RNA合成経費を消耗品費に計上した。