A mechanism to generate the stably suppressive regulatory T cells

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K16279
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 川上 竜司 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 特定助教 (70869114)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 免疫寛容

Outline of Annual Research Achievements

胸腺におけるFoxp3陽性制御性T細胞 (regulatory T cell; Treg) の分化機構を探索すべく、今年度は以下の検討を行った。
胸腺内でのTreg細胞の発生には、T細胞受容体（T cell receptor; TCR）とインターロイキン-2 (IL-2) による刺激が必要であると考えられている。これらは、Tregのマスター転写因子Foxp3の発現に必須である。本研究では、まず胸腺におけるCD4陽性CD8陰性の新生ヘルパーT細胞分画のうち、制御性T細胞系譜とは考えられていないCD25, Foxp3共陰性細胞に着目した。
CD25, Foxp3共陰性細胞は、GPI結合糖タンパク質CD24とMHCクラスI関連遺伝子であるQa-2抗原特異的な抗体を用いて、フローサイトメトリーにより2分画できることを発見した。CD24陽性Qa-2陰性分画は、in vitroでIL-2存在下でのTCR刺激により30%程度の細胞がFoxp3陽性Tregに転換したのに対し、CD24陰性Qa-2陽性分画は5%以下であった。一方で、炎症性サイトカインIFN-gammaを指標にヘルパーT細胞分化能を調べると、Foxp3誘導とは逆に、CD24陽性Qa-2陰性分画はほとんどIFN-gを産生しなかったのに対し、CD24陰性Qa-2陽性分画は多量のIFN-gを産生した。また、末梢の脾臓やリンパ節由来のL-セレクチン陽性ナイーブCD4T細胞はCD24陰性Qa-2陽性分画に似てTreg分化能は低く、ヘルパーT細胞分化能力が高かった。以上の結果から、胸腺内のCD4陽性T細胞は当初Treg分化能を持つが、T細胞の成熟に伴い徐々にTreg分化能を減弱し、ヘルパーT細胞分化能を高めることが示唆された。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の研究計画の手順にしたがって研究を進め、実験系に大きな瑕疵はなく、コアなデータはいずれも再現良く実験が実施できている。本研究の基盤的なデータ収集を達成することができた。
実験に使用するマウスの飼育と遺伝子改変体の掛け合わせを数世代すすめ、コロニーの拡大を行い、短期間に大量のデータを集めることができる基盤が整った。また、ゲノム上のオープンクロマチン領域をより解像度高く解析するOMNI-ATAC-seqの予備検討を行い、20検体程度を短期間に検査する実験系を樹立した。さらに、CD4陽性T細胞特異的Cas9KIマウスとガイドRNA発現レトロウイルスベクターを用いて、遺伝子ノックアウト実験を行う予備検討を完了し、遺伝子ノックアウト実験が可能となった。これにより、今年度以降、胸腺Treg分化に関わる候補遺伝子の機能を調べることが可能となる。以上から、研究の基本となる、「基本的な発見」「複数の視点による肉付けと裏打ち」「仮設の導出」「基盤メカニズムの分子レベルの検証」という各段階を、順調に踏むことができていると考える。
一方で、新型コロナウイルス対応により研究室への出入りが制限されたため、マウス実験は縮小せざるを得なくなり、実験計画の進行が大幅に遅延した。そのため、当初実施する予定であった、胸腺T細胞のTreg分化ポテンシャルとTreg-typeエピゲノム形成との関わりを解析することができなかった。これらは今年度上旬に実施する予定である。

Strategy for Future Research Activity

(1) 前述のTreg分化能の高い/低い胸腺内CD4T細胞分画において、TCR刺激、IL-2刺激をそれぞれ、あるいは組み合わせて行った場合の、Treg-typeエピゲノム形成に及ぼす影響をATAC-seqによるオープンクロマチン解析等で評価する。
(2) Treg分化に重要なエンハンサーの同定を目指し、CRISPR/Cas9システムを用いたエンハンサー領域ノックアウトマウスの解析を実施している。この解析により、Treg分化に重要な遺伝子領域を絞り込むことができる。さらに、前述のTreg分化能の高い/低い胸腺内CD4T細胞分画において、それらがオープンクロマチン状態がどのようになっているか、あるいはどのような転写因子により占有されているかを、ATAC-seqによるオープンクロマチン解析やChIP-シークエンス法によって解析する。これらの実験の予備検討はすでに完了しており、すぐに実施できる状況である。
(3) これらの解析で得られた胸腺Treg分化に重要な遺伝子の候補について、in vivoの遺伝子ノックアウトにより解析する。CD4陽性T細胞特異的Cas9KIマウスとガイドRNA発現レトロウイルスベクターを用いて、遺伝子ノックアウト実験を行う予備検討を行い、遺伝子ノックアウト実験が可能であることを前年度に確認した。これにより、今後は遺伝子ノックアウト処置をした造血幹細胞移植により、生体内で胸腺Treg分化に重要な遺伝子の同定を目指すことができる。

Causes of Carryover

新型コロナウイルス対応により研究室への出入りが制限されたため、マウス実験は縮小せざるを得なくなり、実験計画の進行が大幅に遅延した。そのため当初実施する予定であった、フローサイトメトリー解析と次世代シークエンス解析による胸腺T細胞のTreg分化ポテンシャルとTreg-typeエピゲノム形成との関わりを解析することができなかった。これらは次年度上旬に実施する予定である。