2020 Fiscal Year Research-status Report
BAP1シグナルパスウェイ上の分子を用いた悪性中皮腫診断・治療法確立の基礎的検討
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20K16399
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| Research Institution | Hyogo Medical University |
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Principal Investigator |
木村 美智 兵庫医科大学, 医学部, ポスト・ドクター (80867804)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 悪性中皮腫 / BAP1 / NCOR1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
悪性中皮腫（Malignant Mesothelioma：MM）は化学療法等治療抵抗性で極めて予後不良の腫瘍である。本腫瘍ではBAP1の高頻度変異が生じる。所属研究室では、BAP1野生型患者においてBAP1シグナルパスウェイ上の転写調節因子であるNCOR1の欠失が20%程度生じることを見出した。NCOR1変異がMM発症へ及ぼす影響を検討することにより、MMの早期診断や治療法確立に役立てることを目的とする。
本課題期間中、NCOR1のMM病態への関与を①in vitroレベル（MM細胞株）②in vivoレベル（Ncor1変異導入マウス）③前臨床POC(proof of concept)レベル（患者由来生体試料、薬剤探索）で検証する。
まず、①NCOR1ホモ欠失のMM細胞株でWestern BlottingにてNCOR1タンパク発現消失を確認した。
また、②Ncor1コンディショナルノックアウトマウスを作製中である。Ncor1の一部exonをCre/loxPシステムによりノックアウトするため、該当exonを挟み込むよう2個のloxP配列を同方向に配置するための塩基置換用オリゴDNAを設計し、CRISPR/Cas9システムを用いたゲノム編集を構築した。Cas9タンパクと塩基置換用オリゴDNA，ガイドRNAでRNP複合体を形成しエレクトロポレーションでマウス受精卵に導入した結果、複数のfloxマウスを得た。現在、Creリコンビナーゼ存在下Ncor1のexon 11を欠失する系が先行している。また、同時に片アレルNcor1のexon 11欠失マウスも複数匹得ることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
②in vivoレベルでは当初予定していたNcor1ゲノム編集マウスの購入が困難であった為、ゲノム編集マウス作製に変更した。初回のゲノム編集マウス作製で予定通りマウスが得られた。
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| Strategy for Future Research Activity |
①in vitroレベルでは、中皮細胞においてもNCOR1がBAP1の制御を受けているかについてMM細胞株を用いBAP1およびNCOR1ノックダウンによる遺伝子発現変動を調べる。NCOR1欠損MM細胞株にNCOR1を遺伝子導入し強制発現させたいが、本遺伝子にはエクソン組合せの多様性の高いsplicing variantsが40種以上存在し、どのvariantsを発現させるか検討が必要である。強制発現後1.細胞増殖能の変化、2.DNAダメージ付与後のDNA損傷応答の検出、3.アポトーシス感受性に変化が生じるかなどを解析し、NCOR1のMM発症への寄与度を検討する。
②in vivoレベルでは、初年度に作製したfloxマウス、及び片アレルNcor1欠損マウスを各々交配させることによりF1を作製し、系統維持を計る。Creリコンビナーゼ組換えAdendovirusをゲノム編集マウスへ胸腔内投与し、中皮細胞特異的Ncor1ノックアウトマウスを作製し、その機能解析を今年度内に着手する予定である。また、他のexon欠失マウス作製にも着手する。
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| Causes of Carryover |
計画当初は、複数個所でCRISPR/Cas9ゲノム編集によりexon欠失予定であったが、塩基置換用オリゴDNA設計を工夫することにより一回のゲノム編集実験で目的マウスを得ることができたので、使用経費が最小限に抑えられた。
また、コロナウイルスの感染予防として学会がオンライン開催になったので旅費支出がなくなった為、次年度使用額が生じた。
繰り越し分はほかのexon欠失マウス作製に使用する予定である。
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