2020 Fiscal Year Research-status Report
Development of seed sequences for oligonucleotide therapeutics targeting neurodegenerative disorders
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20K16452
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| Research Institution | Saitama Medical University |
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Principal Investigator |
米田 竜馬 埼玉医科大学, 医学部, 助教 (00734881)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | lncRNA / 相分離 / TLS/FUS / cyclin D1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、がん細胞の増殖を抑える候補配列として同定した13塩基のRNA配列5'1-1を用いた研究を進めた。その結果、TLS/FUSの相分離を5'1-1が阻害することを見出し、この成果をscientific reportsに論文として発表した。さらにpncRNA-Dのメチル化に関する研究を、第43回日本分子生物学会年会におけるワークショップで発表した。
また、TLS/FUSの相分離を確認するための手段として、GFP融合TLS/FUSの安定発現細胞を作製した。TLS/FUSの過剰発現は一過性でも細胞毒性が見られるため、TLS/FUSをノックアウトしたHAP-1細胞を用いて作製した。その結果、TLS/FUSの野生型及びH517D、R521G変異型とGFPタンパク質を融合したタンパク質を発現する安定発現細胞株の作製に成功した。これらの安定発現細胞株を用いて、TLS/FUSの相分離が細胞に与える影響や、総分離を阻害する試薬の影響を観察した。安定発現細胞株でGFP-TLS/FUSの総分離を観察した結果、H517D, R521Gいずれの変異体でもほとんどのGFP蛍光は核内で見られた。しかし一部の細胞では細胞質で凝集体を形成しているTLS/FUSも観察できた。
TLS/FUSは高浸透圧ストレスなどの細胞ダメージを与えることで、細胞質で凝集体を形成することが知られている。そこで、0.4M sorbitolで細胞を処理したところ、野生型、及び変異型TLS/FUS安定発現細胞株で多くの凝集体が観察できた。これらの凝集体が、0.4M sorbitolと同時に1,6-hexanediolを処理することで、どう変化するか検証していく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
lncRNAであるpncRNA-Dの一部である5'1-1を用いた研究結果を論文として発表することがき、GFP-TLS/FUS(野生型及び変異型)の作製にも成功した。また当初は予定していなかった変異体の安定発現細胞株も作製し、細胞実験は順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
13塩基のRNA配列5'1-1の細胞増殖やTLS/FUSの相分離への効果をある程度確認することができたので、今後はpncRNA-Dの他の配列を繋げて同様の実験を試みる。13塩基のRNA配列である5'1-1だけでは、HeLa細胞の増殖をそれほど抑えることができなかったため、pncRNA-Dの他の配列を繋ぎ、その効果を検証する。
またGFP-TLS/FUS安定発現細胞株を用いて、5'1-1が細胞内でもTLS/FUSの相分離、凝集体形成を阻害できるか確認する。TLS/FUSの総分離を阻害する試薬である1,&-heanediolを用いて、GFP-TLS/FUSの相分離や細胞増殖への影響を濃度別に検証する。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍において必要としている消耗品の在庫がない時期があり、購入できない状態が続いたため。
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