樹状突起における局所翻訳が高次脳機能に果たす役割の解明

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K16463
• Research Institution: Center for Novel Science Initatives, National Institutes of Natural Sciences
• Principal Investigator: 大橋 りえ 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(新分野創成センター、アストロバイオロジーセンター、生命創成探究, 生命創成探究センター, 助教 (40867529)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 局所翻訳 / mRNA輸送 / 樹状突起 / 高次脳機能 / Arf GEF, GAPファミリー / 3'UTR

Outline of Annual Research Achievements

神経樹状突起へのmRNA輸送とそれに伴う局所翻訳は、シナプス長期増強に必須の制御機構として知られている。しかし、どのような種類のmRNAが輸送され、それらの翻訳産物がどのように高次脳機能を制御するのか、未解明の点が多い。そこで本研究では、高次脳機能に関与することが既知のRNA結合タンパク質RNG105依存的に、樹状突起へ局在化するArf GEF, GAPファミリーmRNA群に着目した。神経細胞およびマウス脳内において、これらmRNAの樹状突起への輸送を操作し、シナプス長期増強ひいては種々の行動様式に与える影響を解析する。これにより、局所翻訳新規候補遺伝子群Arf GEF, GAPファミリーのmRNA輸送と局所翻訳を介した新たな高次脳機能制御機構の解明を目指す。
昨年度、Arf GEF, GAPファミリーのうち1種類のArf GEFについて、輸送責任領域である3’UTRを欠損させたマウスを作出したが、mRNA局在のみならず安定性等にも影響が生じ、細胞体においても翻訳低下が見られた。そこで今年度はこの問題を解決するため、3’UTRのうち細胞体における翻訳に必須の最小領域を同定し、この領域以外の3’UTRを欠損させたマウスを作出した。その結果、細胞体における翻訳量は維持したままmRNAの樹状突起局在のみを低下させることに成功した。現在、このマウスを用いてシナプス長期増強に与える影響を解析している。今後、行動様式に与える影響を網羅的に解析する。また、1種類のArf GAPに関してもmRNAの樹状突起局在のみが低下するマウスの作出を試みている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

昨年度、１種類のArf GEFについて3’UTR全長を欠損させたマウス（Δ3’UTRマウス）を作出した。このマウスでは、海馬樹状突起領域へのmRNA局在化を有意に低下させることに成功したが、同時に、細胞体におけるタンパク質発現量も顕著な低下が見られた。そこで、細胞体における翻訳は維持しつつ樹状突起へのmRNA輸送を低下させるという当初の目的達成を目指し、今年度はまず、Arf GEFΔ3’UTRマウスで欠損させたmRNA輸送責任領域のうち、細胞体における翻訳に必要な最小領域を同定した。GFPの下流に輸送責任領域の様々な部分長をつなげたコンストラクトを神経初代培養細胞に発現させ、細胞体における発現量を解析し、細胞体におけるタンパク質発現に不可欠な領域を同定した。次に、その領域以外の3’UTRを欠損させたマウス（Δ3’UTR-Pマウス）をCRISPR/Cas9システムにより作出し、組織化学的解析を行った。その結果、Arf GEFΔ3’UTR-Pマウスでは野生型マウスと比較して、海馬樹状突起領域へのmRNA局在化は有意に低下したが、細胞体における翻訳量は維持された。そこで、このマウス由来の神経初代培養細胞系において、スパイン形成およびAMPA受容体細胞表面発現を解析中である。また、着目している1種類のArf GAPについても同様の変異マウス作出を試みている。

Strategy for Future Research Activity

Arf GEFに関しては、細胞体における翻訳は維持しつつ樹状突起へのmRNA輸送を低下させたArf GEFΔ3’UTR-Pマウスの作出に成功したことから、今後はこのマウスを用いてシナプス長期増強および行動様式に与える影響を網羅的に解析する。Arf GEFΔ3’UTR-Pマウス由来の神経初代培養細胞においてスパイン成熟・AMPA受容体細胞表面発現を解析する。また、2光子励起ケイジドグルタミン酸法により単一スパインを刺激した際のスパイン肥大化とその維持についても解析を行う。さらに、20種類の行動様式を網羅的に解析し、Arf GEFの樹状突起へのmRNA輸送低下がシナプス形成および行動に与える影響を明らかにする。着目しているArf GAPについても同様に解析を進める。また、mRNA輸送を神経活動依存的にレスキューして行動を評価することを計画しているため、神経活動依存的に任意の遺伝子発現が誘導されるマウスの作出に着手する。

Causes of Carryover

研究代表者が初年度から２年目にかけて所属機関を変更し、それに伴い昨年度はマウスの搬出および新所属機関への搬入という当初は予定していなかったステップが生じた。また、初年度に作出したマウスが目的を満たさなかったことから再度マウスの作出を試みることとなった。これらの理由により実験計画に変更が生じたため、次年度使用額が生じた。現在、目的のマウスを得ることに成功したことから、今後、このマウスを用いて当初予定していた各種解析を進めるために使用する。