2021 Fiscal Year Research-status Report
ゲノム編集を用いた多発性硬化症におけるケモカインCCL20とCCL9の機能解明
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20K16499
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Research Institution | Oita University |
Principal Investigator |
佐知 望美 大分大学, 医学部, 技術専門職員 (90777468)
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Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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Keywords | ケモカイン / 多発性硬化症 / ゲノム編集マウス / 病態モデルマウス |
Outline of Annual Research Achievements |
多発性硬化症におけるケモカインCCL20とCCL9の生理的役割を解明することを目的とし昨年度までに、血液脳関門のアストロサイトを培養し、この細胞に発現するRANK受容体を刺激することでケモカインCCL20とCCL9の遺伝子発現が上昇することを見出した。また、多発性硬化症におけるCCL20やCCL9の生理活性を明らかにするために、CRISPR/Cas9システムを用いてC57BL/6系統の遺伝背景を持つCCL20欠損マウスとCCL9欠損マウスの作製を行い、シークエンス解析によりそれぞれの遺伝子にフレームシフト変異を確認した。さらに、CCL20欠損マウスではホモ接合体が得られELISA法によりCCL20タンパク質の消失を確認した。また、CCL20の受容体であるCCR6の欠損マウスと、CCL9の受容体であるCCR1の欠損マウスの作製に着手した。 今年度は、CCR6の変異マウスについてシークエンス解析により遺伝子にフレームシフト変異を確認し、ホモ接合体が得られたためフローサイトメトリー法によりCCR6消失を確認した。そこで、CCL20欠損マウスとCCR6欠損マウスを用いて多発性硬化症のモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を誘導し、病態スコアおよび体重減少率を観察した。予想に反して病態と体重減少は野生型マウスより増悪化の傾向が見られた。また、脳組織中のCD4+T細胞の数はいずれの欠損マウスにおいても増加し、脊椎でのIL-17A産生量は増加傾向にあった。病理組織の解析では、中枢神経系における炎症細胞浸潤および脱髄が顕著であった。また、CCL9欠損マウスの作製についてはホモ接合体が得られたのでELISA法によりCCL9タンパク質の消失を確認した。CCR1欠損マウスの作製についてはシークエンス解析により遺伝子にフレームシフト変異を確認し、現在ホモ接合体を増やすために交配を進めている。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2年度目までに、血液脳関門のアストロサイトを培養し、この細胞に発現するRANK受容体を刺激することでケモカインCCL20とCCL9の遺伝子発現が上昇することを見出した。また、CRISPR/Cas9システムを用いてC57BL/6系統の遺伝背景を持つ、CCL20及びその受容体であるCCR6欠損マウスとCCL9欠損マウスの作製を行い、ELISA法によりそれぞれのタンパク質の消失の確認を完了している。加えて、CCL9の受容体であるCCR1欠損マウスについてもシークエンス解析により遺伝子にフレームシフト変異を確認しており欠損マウスの作製は順調に進んでいる。 さらに、CCL20及びCCR6欠損マウスでは、多発性硬化症のモデルであるEAEを誘導し、病態スコア、体重減少率、LFB染色によってその病態の増悪化を観察することができた。また、HE染色では脳への細胞浸潤が確認されフローサイトメトリー法により脳組織中のCD4+T細胞の数はいずれの欠損マウスにおいても増加していることを確認した。また、脊椎ではIL-17A産生量の増加傾向がリアルタイムPCR法により確認された。現在この病態のメカニズムについてより詳しい解析を行っている。このことから、多発性硬化症におけるケモカインCCL20とCCL9の生理的役割の解析は順調に進んでいるといえる。
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Strategy for Future Research Activity |
次年度では、CCL20及びCCR6欠損マウスでのEAEの誘導における病態についてより詳しく解析を行い、そのメカニズムについて調べる。例えば、脳組織中のCD4+T細胞の数がCCL20欠損マウスおよびCCR6欠損マウスにおいて増加していることが示されているが、これについてさらに、その中のどの細胞が変動しているのかフローサイトメトリーで解析する。 また、CCR1欠損マウスのホモ結合体を得てフローサイトメトリー法によりその欠損を確認する。CCL9欠損マウスについても多発性硬化症のモデルであるEAEを誘導し、経時的な病態スコアや体重変化を野生型やCCR1欠損マウスと比較する。また、脳サンプルを用いたLFB染色により脱髄の程度を観察することでその病態について比較する。さらに、脳サンプルについてHE染色を行い炎症性細胞浸潤の程度を比較観察することでCCL20欠損マウスと同様、病理学的解析を行う。また、フローサイトメトリー法による脳組織中の免疫細胞の局在の変化に対する比較や、脊髄サンプルを用いた各種サイトカインの増減をリアルタイム法により比較することにより、CCL20欠損マウスと同様、細胞免疫学的解析を行う。これらの解析結果の英文学術誌への投稿準備を進める。
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Causes of Carryover |
各種欠損マウスの作製が当初の計画より順調に進んだ結果、マウス作製費を削減することが出来た。加えて、病態モデルマウスの作製が比較的スムーズに進行した結果、消耗品の発注が想定より少なく済んだ。 当該助成金は請求した助成金と合わせ、引き続き消耗品や実験動物管理費等として使用し、さらに論文執筆や投稿料としても使用予定である。
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[Journal Article] Protease inhibitory activity of secretory leukocyte protease inhibitor ameliorates murine experimental colitis by protecting the intestinal epithelial barrier2021
Author(s)
Ozaka S, Sonoda A, Ariki S, Kamiyama N, Hidano S, Sachi N, Ito K, Kudo Y, Minata M, Saechue B, Dewayani A, Chalalai T, Soga Y, Takahashi Y, Fukuda C, Mizukami K, Okumura R, Kayama H, Murakami K, Takeda K, Kobayashi T.
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Journal Title
Genes to Cells
Volume: 26
Pages: 807~822
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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[Presentation] Zika virus induces Th17 cell-attracting chemokines in the central nervous system and exacerbates neurological disorders.2021
Author(s)
Naganori Kamiyama, Benjawan Saechue, Astri Dewayani, Chalalai Thanyakorn, Sotaro Ozaka, Shimpei Ariki, Chiaki Fukuda, Yasuhiro Soga, Mizuki Minata, Nozomi Sachi, Shinya Hidano, Takashi Kobayashi.
Organizer
第44回日本分子生物学会年会
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[Presentation] 大建中湯のSLPI発現増強を介した腸管保護作用の解析.2021
Author(s)
皆田美月, 小坂聡太郎, 有木晋平, 神山長慶, 佐知望美, Benjawan Saechue, Astri Dewayani, Thanyakorn Chalalai, 曽我泰裕, 福田千瑛, 水上一弘, 村上和成, 小林隆志.
Organizer
第44回日本分子生物学会年会
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[Presentation] Verification of T cell inhibitory effect of lipid mediator Oleylethanolamide2021
Author(s)
Yasuhiro Soga, Naganori Kamiyama, Takashi Ozaki, Benjawan Saechue, Astri Dewayani, Nozomi Sachi, Sotaro Ozaka, Shinpei Ariki, Thanyakorn Chalalai, Chiaki Fukuda, Takashi Kobayash
Organizer
第44回日本分子生物学会年会
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[Presentation] "Identification of a responsible amino acid in prME protein for cell entry of Zika virus using single-round infectious particles (SRIPs)"2021
Author(s)
Chiaki Fukuda, Naganori Kamiyama, Benjawan Saechue, Astri Dewayani, Chalalai Thanyakorn, Sotaro Ozaka, Shinpei Ariki, Yasuhiro Soga, Mizuki Minata, Nozomi Sachi, Shinya Hidano, Ryosuke Suzuki,Takashi Kobayashi
Organizer
第44回日本分子生物学会年会
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[Presentation] T細胞特異的TRAF6欠損マウスを用いた腸管におけるnon-pathogenic Th17細胞に関する研究2021
Author(s)
有木晋平, 小坂聡太郎, 神山長慶, Benjawan Saechue, Astri Dewayani, Thanyakorn Chalalai, 佐知望美, 曽我泰裕, 福田千瑛, 水上一弘, 村上和成, 小林隆志
Organizer
第44回日本分子生物学会年会
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[Presentation] TRAF6 regulates Th9 cells and cytotoxic T lymphocytes in tumor immunity2021
Author(s)
Astri Dewayani, Naganori Kamiyama, Shinya Hidano, Nozomi Sachi, Sotaro Ozaka, Shimpei Ariki, Benjawan Saechue, Yasuhiro Soga, Thanyakorn Chalalai, Chiaki Fukuda, Takashi Kobayashi
Organizer
第44回日本分子生物学会年会
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[Presentation] C.rodentium感染における樹状細胞におけるTRAF6シグナルの役割2021
Author(s)
Thanyakorn Chalala, Naganori Kamiyama, Shinya Hidano, Nozomi Sachi, Sotaro Ozaka, Shimpei Ariki, Benjawan Saechue, Yasuhiro Soga, Astri Dewayani, Chiaki Fukuda, Takashi Kobayashi
Organizer
第44回日本分子生物学会年会