2020 Fiscal Year Research-status Report
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20K16504
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| Research Institution | Juntendo University |
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Principal Investigator |
池田 彩 順天堂大学, 医学(系)研究科(研究院), 助教 (70867796)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | CHCHD2 / ALS / Mitochondria / CHCHD10 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
CHCHD2 P14L、-8T>G変異を有する患者の脳病理の解析でTDP-43 proteinopathyを認めていた。またP14L変異を有する患者では健常者と比較し、CHCHD2とミトコンドリア抗体(ATP5A)との蛍光二重染色で、CHCHD2がミトコンドリアの局在から外れる傾向を認めていた。患者脳を用いたサルコシル不溶性分画のウエスタンブロット(WB)では、P14L変異患者でCHCHD2とCHCHD10(過去にCHCHD10はALSの原因遺伝子として報告されている)の発現低下を認めていた。
CHCHD2 KOのSH-SY5Y細胞にレトロウイルスでWT、P14L、T61Iのベクターを導入し、それぞれの遺伝子の安定発現細胞を樹立した。これらの細胞を用いて、CHCHD2とATP5Aとの蛍光二重染色と、ミトコンドリア、核、細胞質の分画をした上でWBを行なった。その結果、CHCHD2 P14Lがミトコンドリアの局在から外れる傾向を認めており、脳病理の結果と一致していた。またTDP-43の過剰発現を行ない、サルコシル不溶性分画のWBを行なったところ、CHCHD2 KO、CHCHD2 P14Lでリン酸化TDP-43の高発現を認めていた。
SH-SY5Y細胞で作製した変異体と同じ遺伝子型をもつDrosophilaでは、CHCHD2 KOのDrosophilaでTDP-43が蓄積する傾向にあった。またP14L変異を持つDrosophilaでは、T61I変異を持つDrosophilaよりも、早期にCHCHD2がミトコンドリアから細胞質へと局在が外れる傾向にあった。また、P14L変異を持つDrosophilaではミトコンドリアのCa2+流入の低下と細胞質への流入上昇を認めており、運動ニューロン内のCa2+濃度が上昇することで神経毒性を持ち、ALSを発症する可能性があると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
変異を有するALS患者の脳病理の染色、生化学的解析を行っており、これらの実験を滞りなく進行することができている。
ALS患者群で発見した変異の安定発現細胞の作製ができており、これらの機能解析は順調に進行しており、またコントロールの細胞との比較において、病的な表現型の発見をすることができている。
Drosophilaモデルにおいても同様であり、細胞で作製した際の変異体と同じ遺伝子型を持つDrosophilaの作製は完了しており、こちらも機能解析を進めている。Drosophilaのモデルで発見した病的な表現型に関しては、細胞での結果と一致しており、ALS患者群で発見した変異の病的意義を支持する結果となっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き変異を有する患者脳、細胞、Drosophilaを用いた機能解析を行っていく。機能解析によって、今回発見した変異によるALSの発症のメカニズムまで発見することが目標であり、順次実験を進行していく。具体的には、ミトコンドリアにおけるCa2+代謝の異常が変異を有するDrosophilaで見られており、これはALSの運動ニューロンにおける細胞毒性の原因である可能性があるため、SH-SY5Y細胞でも再現性があるのかどうか解析を行う。また患者脳においてCHCHD2、CHCHD10の発現低下を認めていたため、この傾向がSH-SY5Y細胞でも再現性があるのかどうか解析を行う。また、CHCHD2とCHCHD10は結合してミトコンドリアの電子伝達系で機能することが報告されており、CHCHD2のloss of functionがCHCHD10の機能にも影響を与えている可能性があるため、CHCHD2とCHCHD10の免疫沈降を行い、結合性の低下があるかどうかの確認を行う。
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| Causes of Carryover |
最大限所属施設の共同備品や試薬を使用することで、消費を抑えることができた。
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Research Products
(1 results)
