敗血症診療における迅速網羅的原因菌定量検出および薬剤感受性検査同時検査法の構築

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K16515
• Research Institution: Toho University
• Principal Investigator: 荻原 真二 東邦大学, 医学部, 非常勤研究生 (80790005)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: デジタルPCR / 薬剤感受性検査 / viability PCR

Outline of Annual Research Achievements

感染症診療では診断と治療の遅れが治療の失敗につながり、特に敗血症性ショックでは治療開始が24時間遅れると致命率が90%を超える。現在の敗血症における 診断及び治療に関する検査項目は血液培養検査があるが、検体提出から原因微生物検出(診断)と感受性のある抗菌薬が決定(治療)されるまでに3日以上を要 する。
そこで申請者は、viability PCR法とデジタルPCR(dPCR)法を応用することで、簡便かつ精度のよい迅速微生物定量検出法と薬剤感受性検査法(viability-dPCR 法)を考案した。
新法は短時間の抗菌薬暴露で微量生菌サンプルの定量変化を識別できる。
令和4年度は以下の２つの検討を行った。
検出感度を上げるためにmulti copy numberの遺伝子領域のプライマープローブセットを作成した。新たに作成したプライマープローブセットはviability-qPCRでは増幅可能であったが、dPCRでは増幅が確認できず、プライマープローブの改良に時間を要した。改良したプライマープローブセットでviability-dPCRでの増幅を確認することができた。さらに様々なPCR温度と時間で検証を行い最適なPCR条件を考案できた。
さらに抗菌活性の原理が異なる抗菌薬3種を検討した。抗菌薬はMEPM, GM, CLを用いた。MEPMでは抗菌薬暴露によるviability-PCRで感性株で有意にコピー数の減少が確認でき、耐性株ではコピー数の減少が確認できなかった。一方でGM, CLは感性株、耐性株ともにコピー数の減少が確認でき、viability-PCRには不適であると確認できた。今後、MEPMを中心に検討を続けていく。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

コロナ検査業務に時間を要してしまい、想定していた研究段階に進めることができなかった。

Strategy for Future Research Activity

これまでの研究により1時間の抗菌薬暴露で薬剤感受性検査の判定が可能であることを示した。今後は敗血症患者と同等の菌数まで減少させたサンプルを用いて、複数の菌種による抗菌薬暴露による viability-PCRの有効性を検証する。

Causes of Carryover

デジタルPCR消耗品に充てるためだった予算が計画通りに使用できなかったため、残額が生じた。 今年度予算は残額を合わせて、主にデジタルPCR消耗品および菌株購入費用に充てる予定である。