2020 Fiscal Year Research-status Report
肺ＭＡＣ症の慢性肉芽形成時のマクロファージ機能変化解明ーmicroRNAの役割
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20K16527
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| Research Institution | Kagoshima University |
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Principal Investigator |
郡山 豊泰 鹿児島大学, 医歯学域鹿児島大学病院, 臨床検査技師 (60723616)
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| Project Period (FY) |
2020-02-01 – 2023-03-31
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| Keywords | Macrophage / 肺MAC症 / ｍTOR / 肉芽腫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、4月初めより育児休業を取得し1月より研究を実施しているため残りの期間で試薬の購入や菌株準備を含めて実施した。 まず初めにM. avium を感染させたマクロファージの機能を検討するために、細胞死を誘導しない菌量と感染条件の設定が重要であると考えているので順次進める予定である。感染させる菌株は、M. avium ATCC 700898を購入し、小川培地を用いて37℃で約1か月培養する。感染させる細胞には、ヒト単核球系細胞(THP-1、U937細胞) を Vitamin D またはPMA を用いて分化させたマクロファージ様細胞とマウス腹腔マクロファージRAW264.7 細胞を用いて感染条件の検討を行う予定である。次に感染させる菌株は、小川培地で発育させたのち単一コロニーをMiddleBrook7H9液体培地で増菌培養する。菌量は、希釈液を作成しMiddleBrook7H9 平板培地で計測する予定である。これらの細胞死しない感染条件を設定するために下記について最適条件を検討する予定である①細胞死の有無について TUNNEL 法および PI 法を用いてフローサイトで確認する。②感染マクロファージの Caspase-1, -3, -8、をウエスタンブロット法で確認する。③細胞内 ROS 産生能について H2DCFDA/MitoSOX を用いてフローサイトで確認する。④サイトカイン産生能について 細胞培養上清の IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、IL-17、INF-γを ELISA 法で測定する。設定された感染条件により本申請の目的に最適な培養細胞株の一つを選定し、マイクロアレイを実施する。感染細胞から RNA を抽出して microRNA のプロファイリングを行う予定である。プロファイリングされたmicroRNAから数種類選択し、リアルタイムPCRを行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度の初めより育児休業を取得し予定よりやや遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、行っている感染条件の設定(MOI)を行うために下記の実験を並行して行う。①細胞死の有無についてTUNNEL 法およびPI 法を用いてフローサイトで確認する。②感染マクロファージのCaspase-1, -3, -8、をウエスタンブロット法で確認する。③細胞内ROS 産生能について H2DCFDA/MitoSOX を用いてフローサイトで確認する。④サイトカイン産生能について 細胞培養上清のIL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、IL-17、INF-γをELISA 法で測定する。
これらの結果を踏まえて、最適条件でマイクロアレイを実施を行う。
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