FRETに基づくトシリズマブの新規HPLC法の開発と薬物相互作用解明への応用

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K16530
• Research Institution: Tokyo University of Science, Yamaguchi
• Principal Investigator: 高田 誠 山陽小野田市立山口東京理科大学, 薬学部, 助教 (60551348)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: HPLC / 蛍光検出 / トシリズマブ / FRET / 薬物相互作用解明 / 抗体医薬品 / COVID-19 / サイトカインストーム

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、分子間蛍光共鳴エネルギー移動に基づくトシリズマブ（TCZ）の新規HPLC分析法の開発と薬物相互作用解明へ応用することを目的としている。現在、TCZなどの抗体医薬品の定量には、抗原抗体反応を利用したリガンド結合法やLCMS/MS法が主に用いられている。しかしながら、いずれの方法も前処理操作が煩雑であることや測定にかかる時間やコストなどの問題点から、臨床現場では汎用されていない。本研究の目的とする分析法は、煩雑な前処理を必要とせず迅速・簡便かつ安価な分析法であることから、TCZによる薬物治療における有用なツールとなり得る。
当該年度では、昨年度までに開発したトシリズマブの自然蛍光検出による新規HPLC定量法について、更なる迅速化と回収率の改善を目的とした前処理方法の検討を行った。本法は、前処理にオクチルアミンを用いることで、抗原抗体反応やトリプシン消化などの煩雑な前処理を必要とせず、15分程度で前処理を含めた測定が可能であり、これまでの測定法と比べて非常に迅速かつ簡便な方法であると言える。加えて、近年、TCZはCOVID-19によるサイトカインストームにも適応が追加され、ステロイド薬と併用して用いられている。サイトカインストームの際にはこれまでC反応性たんぱく（CRP）により効果の確認が行われていたが、CRPの応答性は24時間程度と緊急性を要する状況において適した治療効果の確認法であるとは言えなかった。また、血中のTCZを直接測定可能なLC-MS/MS法やELISAについても、前処理にかかる時間の点で同様の問題を抱えていた。この点において、本法は緊急性を要する際に直接血中TCZを測定するのに有用であると考える。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

当該年度は開発したトシリズマブの自然蛍光検出によるHPLC分析法について、回収率の向上を目指し、アルキル鎖がさらに長いアミン類を用いる等の前処理方法の再検討を行った。その結果、昨年度までの方法と比較して迅速性と回収率が向上した。感度の面では関節リウマチ治療における治療域には不十分だったものの、COVID-19のサイトカインストーム時の治療における血中濃度を測定することが可能な結果が得られた。

Strategy for Future Research Activity

当該年度開発したトシリズマブの自然蛍光検出によるHPLC定量法は、非常に簡便かつ迅速な方法である一方、感度の面では改善の余地があった。そこで現在は、選択性の向上を目指し、市販のDansyl系蛍光試薬を用いて、TCZ由来の自然蛍光とFRETを起こす蛍光試薬をスクリーニングする。一方で、COVID-19によるサイトカインストーム時に用いられるTCZの治療効果を確認するのに必要な感度を満たしていたため、自然蛍光検出による迅速かつ簡便な分析法についても引き続き検討を行っていく。また、他の抗体医薬品への応用の可能性が示唆されたため、薬物相互作用解明を目的として、関節リウマチ治療薬である抗体医薬品のインフリキシマブへと本法を適用する。

Causes of Carryover

当該年度は、トシリズマブの自然蛍光検出による迅速かつ簡便な新規HPLC分析法を開発したため、FRET用蛍光試薬のスクリーニングを行わなかった。そのため、蛍光試薬購入用の予算が余剰として残った。次年度、改めてスクリーニングを行う予定であり、それに伴い蛍光試薬購入に予算を使用する予定である。