2021 Fiscal Year Annual Research Report
遺伝子標的型殺菌キメラファージを用いた遺伝子変異の簡易検出法の開発
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20K16557
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| Research Institution | Jichi Medical University |
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Principal Investigator |
相羽 由詞 自治医科大学, 医学部, 助教 (60783694)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 簡易検査法 / 薬剤耐性菌 / CRISPR-Cas13a / バクテリオファージ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
抗菌薬が効かない薬剤耐性菌の出現と蔓延は世界規模での医療問題である。その対応策として、臨床現場では耐性菌を早期に簡便かつ安価に検出する技術が求められている。 現在、我々の研究チームはCRISPR-Cas13aシステムを搭載したバクテリオファージを用いて、薬剤耐性菌の原因遺伝子を鑑別することができる検査法の開発を行なっている。本研究の目的は、RNA標的型CRISPR-Cas13システムを搭載したバクテリオファージを用いて、核酸の増幅を必要としない細菌遺伝子変異を検出することができる検査法の確立である。申請者は、カルバペネマーゼ産生腸内細菌科細菌が持つIMP-1(A640)とIMP-6(A640G)をモデル遺伝子に用いて、1塩基の違いを高感度に検出することができるガイドRNA配列を探索した。両遺伝子の違いを識別できるCRISPR-Cas13aを特定するために、合計56種類のガイドRNAを設計し、殺菌効果を比較した。遺伝子変異検出で最も感度の高かったガイドRNA配列は、10^-6以上の有意な変異識別による細菌の増殖抑制が認められた。その一方で、ほとんど殺菌効果を示さない配列も多数存在した。そのため、ガイドRNAを慎重に工夫して設計することで、わずか1塩基の違いも鑑別出来ることを明らかにした。さらに、Cas13aとパーケージング機能を結合させたファージミドを持つ菌を構築した。そこに、ファージ合成に必要なヘルパーファージを感染させ、特異的配列を識別する CRISPR-Cas13a 搭載した抗菌カプシドを作製した。今後、抗菌カプシドの収率向上や安定化に関する詳細な検証を進めていくことで、効果的な核酸の増幅を必要としない細菌遺伝子変異の簡易検査法の確立を目指す。
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