2020 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the molecular mechanism of D-serine - AMPA receptor interaction and its application to the development of a treatment for schizophrenia
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20K16655
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Research Institution | Showa University |
Principal Investigator |
海野 真一 昭和大学, 医学部, ポストドクター (00735855)
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Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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Keywords | 統合失調症 / D-セリン / 神経薬理学 |
Outline of Annual Research Achievements |
CaP-AMPA受容体―D-セリン相互作用に関する基礎的研究を行うため、D-セリンの局在を明らかにする目的で種々の実験法を確立した。 GAD67コンディショナルノックアウトマウスの脳からRNAを抽出し、RT-PCR法にてGAD67及びSRRの遺伝子発現量を調べた。結果はGAD67の遺伝子発現量は減少しSRRの遺伝子発現量は上昇していた。 また、抗D-セリン抗体の特異性の検証を行うためにD-セリンとグルタルアルデヒド結合体を特異的に認識する抗体を用いて組織凍結切片の免疫染色法を確率した。グルタルアルデヒド(0.25%)を含むパラフォルムアルデヒド(4%)を用いて灌流固定したSRRKOマウスの脳より作製した脳切片で、抗D-セリン抗体を使って、組織中D-セリンの免疫染色を行った。野生型マウスの大脳皮質、海馬等の灰白質および白質でD-セリン様免疫反応が認められ、HPLCによる組織中D-セリン濃度の定量結果と矛盾しなかった。SRRKOマウスにおいては、D-セリン様免疫反応の低下傾向が見られたが、動物数が少なく、脳切片の状態が良くないため、来年度に、SRRKOマウスを凍結受精卵から個体化し、再度検討する計画である。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の予定通り、CaP-AMPA受容体による細胞外D-セリン濃度の減少に関係する分子群を見出す基礎実験の準備が整い実験を円滑に進めることができた。 すなわち、In vivoマイクロダイアリシスの実験において、細胞外液を回収するために購入したマイクロフランクションコレクターの準備が整い、D-セリン免疫染色用の凍結切片を作成するために必要なクライオスタットや細胞外液中のD-セリン等を計測するHPLC用のオートサンプラーの修理も完了した。 一方、D-セリン合成酵素であるセリンラセマーゼ(SRR)を欠損し脳のD-セリンが対照群の10%程度に減少するマウス(SRRKOマウス)では、抗D-セリン抗体に対する免疫反応の減弱が観察され、HPLCによるD-セリンの定量の結果とも一致し、本抗体の特異性が示唆された。しかし凍結切片の状態が良好ではなかったことから、2021年度に再実験を行う予定あるが、凍結受精卵で保存しているSRRKOマウスを個体化する作業が進んでいる(高度な専門技術が必要なため外部施設に委託している)。
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Strategy for Future Research Activity |
抗D-セリン抗体を使った、脳におけるD-セリンを含有する細胞や細胞内構造の検討を継続する。本抗体の特異性を、凍結受精卵からの個体化により、D-セリン合成能をもつセリンラセマーゼ(SRR)を欠損したマウスを作出して、D-セリンへの免疫反応や、グリシンやL-セリンに対する反応を比較することによって検討する。またD-セリン様免疫反応の解析を、光学顕微鏡だけでなく電子顕微鏡によっても進める。 また、2013年に我々の研究グループが初めて報告した、カルシウム透過型AMPA受容体による細胞外D-セリン濃度の調節の分子細胞機構を明らかにする目的で、細胞内カルシウム動態で重要な役割を果たす分子として知られ、D-セリンとの相互作用が未検討である、II型IP3受容体との関係を調べる研究を開始する。すなわち、IP3RIIKOマウスの内側前頭葉皮質において、マイクロダイアリシス法を用いて細胞外D-セリン濃度への影響を検討すする。さらに、AMPA受容体作動薬、ベラトリジンによる脱分極、テトロドトキシンによる神経伝導遮断、細胞外カルシウム除去およびIP3受容体遮断薬、等の効果を、対照群のマウスと比較する。
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Causes of Carryover |
コロナウィルスの蔓延して通常業務に支障が生じ、予定の進行が遅れたため。
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