Epigenetic changes in the central nervous system and peripheral blood of offspring rats exposed to VPA during fetal life.

2023 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K16678
• Research Institution: Juntendo University
• Principal Investigator: 金城 智也 順天堂大学, 医学部, 非常勤助教 (80750364)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2025-03-31
• Keywords: バルプロ酸 / PBMC / ADHD / アセチル化 / リンカーヒストンH1 / ヘテロクロマチン

Outline of Annual Research Achievements

抗てんかん薬のバルプロ酸ナトリウム(VPA)を妊娠中服薬していた妊婦から生まれた児は発達遅延とともに注意欠陥多動性障害(ADHD)リスクの上昇が指摘されている。本研究ではその診断補助の基礎研究として、動物実験において末梢血と中枢神経のエピジェネティクな関係性の解明を目的とした。妊娠12.5日目のラットにVPA(200mg/kg)を連日腹腔内投与し、生後4週齢及び20週齢の仔ラットを研究対象とした。行動実験は4週齢のみ行い、VPA群において多動が観察された。生後4週齢の全血のRNAサンプルを用いてRNA-seq解析を行った結果、VPA群において、遺伝子発現の増加（約24 %）と低下（約76 %）が観察された。生後4週齢と20週齢の灌流固定した脳組織を用いて免疫蛍光組織染色を行った結果、4週齢のVPA群では、ヒストンH3とH4それぞれのヒストンテールのリジン残基が、有意に低アセチル化状態になっていた。一方、20週齢のVPA群では、アセチル化の低下傾向は観察されたものの、有意差は認められなくなっていた。生後4週齢の末梢血単核球(PBMC)のヒストン抽出物を用いてウエスタンブロッティング解析を行った結果、ヒストンH3とH4のアセチル化低下と、ヒストンH1の発現増加が、有意に観察された。さらに、このヒストン抽出物をネガティブ染色し、電子顕微鏡観察を行った結果、VPA群において、クロマチンの凝集が観察された。生後4週齢と20週齢の脳組織も電子顕微鏡観察を行ったところ、4週齢において、細胞核内のヘテロクロマチンの増加が観察された。20週齢においては、クロマチンの異常は回復していた。
令和5年度の主な実績としては、脳組織において、多数のリジン残基アセチル化変化の検出、PBMCにおいて、ヒストンH3とH4のアセチル化とリンカーヒストンH1の定量的検出に成功し、それぞれのクロマチンが異常な状態であることを見出した。

Current Status of Research Progress

1: Research has progressed more than it was originally planned.

Reason

今回、VPA群において、遺伝子発現低下が多かった事と、リンカーヒストンH1の増加を発見したことによって、ヒストン蛋白質の凝集およびヘテロクロマチンの増加が示唆され、電子顕微鏡観察を実施するに至った。
結果、予想以上にヘテロクロマチン化が進んでおり、多動性行動異常の重要な分子メカニズムを見出した可能性が示唆された。

Strategy for Future Research Activity

末梢血のRNA-seqデータを詳細に解析する。具体的には、エピジェネティックあるいは多動性行動異常に関連した変動遺伝子の抽出、ヒートマップおよびボルケーノブロットによる変動遺伝子の可視化、パスウェイ解析等である。
これらのデータマイニングが完了した後、そのデータを論文に追加し、投稿する予定。

Causes of Carryover

理由：論文校閲やリバイス等の予算確保

使用計画：論文校閲およびリバイスの必要試薬に使用する予定。