2020 Fiscal Year Research-status Report
ケトン性低血糖症の病因としてのPHKA2遺伝子p.G991Aバリアントの意義
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20K16850
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| Research Institution | Gifu University |
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Principal Investigator |
堀 友博 岐阜大学, 医学部附属病院, 助教 (90456525)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ケトン性低血糖症 / 糖原病IX型 / ホスホリラーゼキナーゼ / PHKA2遺伝子 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
発現ベクターとしてpcDNA3.1(+)を用い、wild-type PHKA2 cDNAを挿入し、Wild-type PHKA2発現ベクターを作成した。このベクターから、KOD-Plus-Mutagenesis Kitを用いてG991A変異を導入し、p.G991A変異 PHKA2発現ベクターを作製できた。HEK293T細胞（ヒト胎児由来腎臓細胞）を培養し、Wild-type・p.G991A変異 PHKA2発現ベクターをそれぞれ別のHEK293TにLipofectamine 2000を用いて導入し、48時間後に細胞を回収し、その一部を用いてPHKA2の発現をイムノブロットで確認することができた。
PhK活性の検討として、Wild-type・p.G991A変異PHKA2発現ベクターを用い、PhK活性を検討した。直接的にPhKの活性を測定することが困難であるため、その基質であるphosphorylase bとATPを添加し、生成物であるphosphorylase aの活性（量）を測定し、培養に要した時間とともにPhKの活性を計算した。その結果、令和3年5月時点でPHKA2遺伝子のp.G991Aバリアントが実際にPhK活性が低下していることをin vitroで有意差をもって証明するには至っていない。しかし、正常対象群のPhK活性に比し、p.G991Aバリアントを有する患者のPhK活性は、ホスホリラーゼbに対するKmが高く（すなわち、ホスホリラーゼｂに対する親和性が低い）、ホスホリラーゼbの濃度が低下すると、グリコーゲンの分解がより抑制される可能性があり、ケトン性低血糖症の病態におけるPHKA2遺伝子p.G991Aバリアントの関与を示唆していると考える。
全国の原因不明のケトン性低血糖症患者に対する調査とPHKA2遺伝子p.G991Aバリアント解析については、症例を集積している段階である。
当院と関連の産院施設で遺伝子解析の承諾を得られた生後１か月児の一般集団におけるp.G991Aバリアントの有無の調査について、アンケートの配布・集積を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
発現実験系の計画について、Wild-type・p.G991A変異PHKA2発現ベクターは構築でき、in vitroの実験計画はおおむね予定通りに進行している。
全国の原因不明のケトン性低血糖症患者に対する調査とPHKA2遺伝子p.G991Aバリアント解析について、症例の集積につき代謝異常症の専門家がいる各施設に呼びかけを行っている。
当院と関連の産院施設で遺伝子解析の承諾を得られた生後１か月児の一般集団におけるp.G991Aバリアントの有無の調査を開始した。
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| Strategy for Future Research Activity |
発現実験系の計画について、PhK活性を温度や環境条件の変更を含め検討している。
全国の原因不明のケトン性低血糖症患者に対する調査とPHKA2遺伝子p.G991Aバリアント解析について、アンケート結果に基づき、ケトン性低血糖症患者を診療している施設へ変異解析を依頼し、承諾が得られた症例について解析を行い、ケトン性低血糖症患者におけるPHKA2遺伝子p.G991Aバリアントを有する頻度を明らかにする。
当院と関連の産院施設で遺伝子解析の承諾を得られた生後１か月児の一般集団におけるp.G991Aバリアントの有無の調査につき、3000例の解析を目標に検体収集を進める。また、これらの小児がケトン性低血糖症を来したか否かについて、２歳時、４歳時に調査を行う予定である。
PHKA2遺伝子のp.G991Aバリアントを有するケトン性低血糖症患者と同バリアントを有しない患者の臨床症状の差異の解析について、アンケート調査でケトン性低血糖症患者の臨床症状や重症度（発症年齢、低血糖の頻度など）を解析し、PHKA2遺伝子のp.G991Aバリアント解析で同バリアントを有する患者群と有しない患者群の間での比較検討を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
主な理由として、新型コロナウイルスの影響により、国内・国外とも学会や出張がほぼ中止・延期・Webによる開催となり、国内旅費の残余が生じた。また、人件費・謝金が発生する研究が予定より予算を使用せず遂行できた。ただし、令和3,4年度にin vitroの発現系実験の引き続き多くの研究の実施が必要となっており、DNA解析試薬、TaqMan試薬、細胞培養試薬、タンパク解析試薬が計画時の予算では不足する見込みであるため、次年度使用額として計上した。
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