2020 Fiscal Year Research-status Report
低酸素性虚血性脳症におけるミクログリアでのLOX-1の役割解明と新規治療法の開発
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20K16875
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| Research Institution | Tokyo Metropolitan Children's Medical Center (Department of Clinical Research) |
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Principal Investigator |
青木 良則 東京都立小児総合医療センター(臨床研究部), 臨床研究部, 医員 (70726629)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 新生児低酸素性虚血性脳症 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
方法①-aで作成したラットミクログリア初代培養細胞に対して、低酸素低血糖（OGD: Oxygen glucose deprivation）負荷を行った（OGD群、方法①-b）。OGD負荷を行っていないコントロール群（CTL群）と比較し、免疫細胞化学、定量PCR、ウエスタンブロッティングを行いLOX-1の発現上昇を認めた。また、培養上清中の炎症性サイトカイン、ケモカインの濃度を測定した結果、OGD群では炎症性サイトカインであるIL-1β、IL-6、TNFα、およびケモカインであるCCL2、CCL3、CCL5の濃度はCTL群に比して有意に高かった。以上より、OGDによりミクログリアでLOX-1の発現が誘導され、炎症性メディエーターの産生も誘導されることがわかり、in vivoの新生仔低酸素虚血モデルラットとの相同性を確認した。
次に、低酸素虚血下でのLOX-1の発現と炎症性メディエーター産生との関連を調べるため、上記のCTL群とOGD群にLOX-1 siRNAを導入した（方法②-a）。方法①-bと同様の解析を行い、OGD群での炎症性メディエーターの産生は、LOX-1のノックダウンにより抑制されることが分かった。さらにマイクロアレイにより網羅的遺伝子発現解析を行い（方法②-b）、OGDによるミクログリアでのLOX-1発現変化と関連がある遺伝子、遺伝子セットを抽出した。また、M1（細胞傷害性）とM2（細胞保護性）の遺伝子発現パターンを比較すると、OGD群ではM1遺伝子の発現上昇、M2遺伝子の発現低下がみられ、LOX-1のノックダウンによりM1遺伝子発現の抑制、M2遺伝子発現の回復がみられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ミクログリアはsiRNA導入が困難な細胞であり、実験条件の検討に時間を要したが、最終的にOGD負荷によるLOX-1の発現は、LOX-1 siRNAの導入により1/3程度に低下し、CTL群と同程度に抑制することができたためこの条件で実験を進めた。その結果、ミクログリアにおける低酸素虚血時の炎症性メディエーターの産生はLOX-1のノックダウンで抑制されることが分かり、LOX-1と直接的、あるいは間接的に関連があると考えられた。ミクログリアの極性という点からは、低酸素虚血負荷によりM1型（細胞傷害性）への極性変化がみられ、LOX-1のノックダウンによりM1マーカー遺伝子の発現抑制、M2マーカー遺伝子の発現回復がみられた。また、低酸素虚血負荷でのLOX-1発現変化と関連がある遺伝子、および遺伝子セットをいくつか抽出できたことから、今後ミクログリアでのLOX-1細胞内シグナル伝達系を解明する上での手がかりが得られたと考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
網羅的遺伝子発現解析によりミクログリアでのLOX-1発現変化と関連があると考えられたシグナル伝達分子について、これらの阻害物をOGD群に投与し、LOX-1の発現変化、炎症性メディエーターの発現変化、細胞のviabilityなどを解析する。これにより、ミクログリアにおけるLOX-1の役割と細胞内シグナル伝達系の存在を明らかにし、LOX-1細胞内シグナル系を標的にした治療法開発の基盤を作ることができる。
最終的にはLOX-1、およびLOX-1細胞内シグナル伝達系を阻害する作用を有する化合物について、本研究で作成したHIE細胞モデルを用いてスクリーニングを行う。OGD負荷を行ったミクログリアにこれらの化合物を投与し、LOX-1の発現変化、炎症性メディエーターの発現・産生変化や、細胞のviabilityの変化を解析する。これにより、in vivoでの検証につなげていくことができる。
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| Causes of Carryover |
国内外での学会での発表を予定し演題登録を行ったが、新型コロナウイルス感染症の影響で学会の開催中止、延期などがあり、旅費の支出がなかった。また、当初の予定より実験の進捗がやや遅れており、物品費の支出も予定より少なかった。
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