ダウン症候群における病態責任遺伝子の同定を可能にする革新的な細胞モデルの確立

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K16891
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 吉松 秀隆 大阪大学, 医学部附属病院, 医員 (90836264)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: iPS細胞 / ダウン症候群 / ゲノム編集 / エピジェネティック編集

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、ダウン症候群に発症する合併症が、21番染色体上のどの遺伝子発現量の増加によって引き起こされるのか、その責任遺伝子を同定することのできる疾患モデル系の樹立を目指す。
具体的には、21トリソミーiPS細胞とゲノム編集技術、X染色体不活化を引き起こすことのできるXIST遺伝子、そしてエピジェネティック編集技術を組み合わせることにより、①21トリソミーiPS細胞の作製とヒトXIST cDNA配列のクローニング　②　ゲノム編集技術によって、ヒトXIST cDNA配列をテトラサイクリンシステム（Tet-ON）制御下に21トリソミーiPS細胞の21番染色体の1本に挿入　③エピジェネティック編集技術による任意の配列におけるDNAメチル化阻害　を可能とする細胞を作製し、ガイドRNAの組み合わせによって“任意の、すべての組み合わせの遺伝子発現をトリソミーにすることができる部分21トリソミーiPS細胞系の樹立”を行う。
初年度である今年度は、すでにクローニング済みであったヒトXISTcDNAの断片をつなぎ合わせたのち、その配列をシークエンスすることで正しくつながっていることを確認した。次にXIST配列をテトラサイクリン誘導システムのTet応答配列とつなげ、CRISPR/Cas9をもちいて21トリソミーiPS細胞の21番染色体の1本に挿入した。さらにZinc Finger Nucleaseをもちいて、19番染色体のAASV1領域にrtTA配列の挿入を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の計画の予定通り、ゲノム編集技術をもちいてiPS細胞へのXIST配列およびrtTA配列の挿入を行うことができた。

Strategy for Future Research Activity

2021年度は、細胞にDoxを加えることによって、XISTが発現すること、21番染色体上の遺伝子発現がサイレンシングを受けることを確認する。さらにその後、エピジェネティック編集を行い、その遺伝子発現が再活性化されることを目指す。