2020 Fiscal Year Research-status Report
Rett症候群に対するMECP2発現調節等を介した遺伝子治療法開発
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20K16901
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| Research Institution | Jichi Medical University |
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Principal Investigator |
宮内 彰彦 自治医科大学, 医学部, 講師 (50570397)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | Rett症候群 / MECP2 / アデノ随伴ウイルスベクター / 遺伝子治療 / 低発現プロモーター / ヒトiPS細胞 / Mecp2欠損マウス / dCAS |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、MECP2関連疾患であるRett症候群の遺伝子治療開発を目的としている。Rett症候群は女児に発症しMECP2の変異により生じるが、MECP2重複の男児でも重度知的障害、難治性てんかんを発症するため、発現遺伝子量の調節が治療で重要となる。さらに、MECP2はX染色体上に存在するため細胞単位のランダムな不活化を受けており、正常なMECP2蛋白質を発現する細胞と発現の無い細胞が混在する。このX染色体の不活性化現象も分子病態の理解を複雑にしており、治療に際しては最適なベクターの作成や、導入(外来)MECP2遺伝子の発現量の制御、及び内在するが不活化しているMECP2の発現調節等の方法の開発が重要となる。
本年度は、まずRett症候群に対する遺伝子治療用のアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの作成を行った。遺伝子治療用ベクターは、神経細胞移行に優れ、中枢神経の広範囲の領域に遺伝子導入可能なAAV.GTXベクターを選択し、プロモーターは遺伝子発現効率の低さから過剰発現のリスクの軽減が期待できるSynIプロモーターを選択した。この低発現プロモーター及びMECP2遺伝子を導入したAAVベクターを作成し、実験必要量を得た。さらに、作成したAAVベクターをヒトiPS細胞から分化させた神経細胞・マウス初代神経細胞へ感染させ、外来性および内在性MECP2発現量の測定を行い発現量のモニタリングが可能であることを確認した。また、MECP2発現量の抑制コントロール法の検討として、MECP2関連疾患のMECP2重複症候群で、重複MECP2の発現を抑制する方法について検討し、miRNA mimicが、MECP2重複症候群患者または非罹患者由来の繊維芽細胞、および非罹患者iPS細胞由来の神経細胞のMECP2 mRNA発現に及ぼす影響を調べ、多くのmiRNA種で発現を抑制できることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
目標としていた遺伝子治療用ベクター作成について、SynIプロモーターとMECP2を組み込んだAAVベクターを作成し、実験必要量を得ることができた。AAVベクターについては、共同研究者の村松慎一教授が独自に開発した神経細胞への移行がいいAAV.GTXベクターを用いた。さらにAAVベクター作成後に培養細胞に導入し、内在および導入（外来）MECP2発現量のモニタリングができることを明らかにした。培養細胞レベルでは、Rett症候群患者に由来するiPS細胞の神経細胞分化にも着手しており、概ね順調に実施ができていると考える。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、遺伝子治療用AAVベクターは、Rett症候群のモデル動物であるMecp2欠損マウスのヘテロ雌に投与し、運動障害等の評価の改善、組織や神経細胞の変化を観察を計画しており、産出個体数が揃い次第、投与を実施する見込みである。なお、マウスやブタへのGFP遺伝子のみのAAVベクターによる脳・神経細胞経路の検討を以前当講座で行っており、大槽への投与で、脳に広範囲に及んだ遺伝子発現を確認できたため、大槽への投与経路で実施を予定している。
また、今後、核酸医薬(miRNA mimic、SiRNA、アンチセンスオリゴ等)や遺伝子編集技術を応用したdCAS9の融合による複合的な方法により、正常遺伝子の発現レベルの制御可能なAAVベクターの構築すべく、現在設計の工程に進んでいる。
さらに、新規変異として、MECP2の281番のアミノ酸変異を持つRett症候群患者由来のiPS細胞を作成を行ったため、今後、 患者iPS細胞由来の神経細胞の変化やX染色体不活性化因子等がMECP2に与える影響についても検討していく。
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| Causes of Carryover |
コロナウイルス流行状況のため、海外での学会発表や情報収集を行うことができなかったことで、旅費その他の支出がなかった。今後、次年度以降の開催に備えて結果報告の準備を進めていき、学会の参加費や旅費その他の支出としての使用を検討している。
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