2020 Fiscal Year Research-status Report
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20K16932
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
浜中 耕平 横浜市立大学, 医学部, 助教 (20801129)
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| Project Period (FY) |
2020-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | Klippel-Feil syndrome / 転座 / ゲノム構造異常 / 全ゲノムシーケンシング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
交付申請書の「研究実施計画」の(1)と(2)について、以下の様に研究成果を得た。
「(1) Klippel-Feil syndrome（KFS）症例におけるゲノム構造異常の同定」：常染色体優性遺伝形式でKFSを発症している1家系において、t(5;8)(q35.1;p21.1)転座を同定した。断端の位置は、短鎖型次世代シーケンサーによる全ゲノムシーケンシングを用いて、1塩基レベルの精度で明らかにした。我々は、別のKFS家系でもこの転座断端周辺に稀な構造異常を認めないか調べるために、DNA量が十分にあるKFSの別の2家系について、全ゲノムシーケンシングを行った。結果、1塩基バリアントや短い挿入・欠失と構造異常を網羅的に同定した。これらのバリアント内で、t(5;8)(q35.1;p21.1)転座の断端周辺のもので一般集団で稀な（マイナーアレル頻度で0.01%以下）構造異常は認められなかった。また、KFSの既知の原因遺伝子に病原性が疑われる稀なバリアントを認めなかった。
「(2)断端の周辺の遺伝子の網羅的発現量解析」：凍結から起こした患者由来のリンパ芽球細胞株が増殖せずに死滅してしまった。また、新たな細胞株を樹立するために患者から新たな血液を主治医から得ることも困難であった。そのため、以前の実験で得られていた、患者リンパ芽球細胞においてFGF〇の発現が上昇しているというプレリミナリーデータの再現を得ることが困難となった。また、RNAシーケンシングによる網羅的発現量解析を行うことが困難となった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
凍結から起こした患者由来のリンパ芽球細胞株が増殖せずに死滅してしまった。また、新たな細胞株を樹立するために患者から新たな血液を主治医から得ることも困難であった。そのため、研究計画の大きな変更を余儀なくされた。
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| Strategy for Future Research Activity |
患者由来のリンパ芽球細胞株が死滅したため、計画していた実験を同様の趣旨のインフォマティクス解析に変更した。具体的には、交付申請書の「研究実施計画」の「(2)断端の周辺の遺伝子の網羅的発現量解析」と「(3) TAD（topology associating domain）の解析」について、以下の様に研究計画を修正した。
「(2)断端の周辺の遺伝子の網羅的発現量解析」：t(5;8)(q35.1;p21.1)転座のFGF〇遺伝子の発現に対する影響を予測するために、ゲノム高次構造を考慮に入れたディープラーニング遺伝子発現予測モデルを作成する。以前の細胞種特異的遺伝子発現予測モデル（Expecto）はプロモーター配列のみを考慮に入れており、TAD内のエンハンサーなどのシスエレメントを考慮に入れていなかった。そこでKerasのFunctional APIを用いて、TAD内のシスエレメントとプロモーターの配列という複数の情報をインプットにもつ、細胞種特異的ディープラーニング遺伝子発現予測モデルを作成する。そして、このモデルを用いて、t(5;8)(q35.1;p21.1)転座によりFGF〇遺伝子の発現量が骨芽細胞で変化することを示す。
「(3) TADの解析」：ゲノム高次構造のディープラーニング予測モデル（AkitaとdeepCなど）を用いて、t(5;8)(q35.1;p21.1)転座断端領域の骨芽細胞における野生型TADを同定する。また、転座によりこれらのTADがどう変化するか解析する。次にプロモーター・エンハンサー相互作用のディープラーニング予測モデル（3DPredictor）を用いて、上記のTAD内でのFGF〇遺伝子のプロモーターとエンハンサーの相互作用の変化を解析する。
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| Causes of Carryover |
患者由来のリンパ芽球細胞株が使用できなくなったため、多くの実験を行うことが出来ず、次年度使用額が生じた。これらの実験の代替として、ディープラーニングを含むインフォマティクス解析を行う。このディープラーニングには、GPU（Graphics Processing Unit）が必要であり、それを提供しているGCP（Google Cloud Platform）やAWS（Amazon Web Service）などのクラウドサービスを使用する。これらのクラウドサービスは、従量課金制でデータストレージ代、クラウドコンピューティング代などがかかり、次年度持持ち越し額はこれらに充てる。
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