Evaluation of mitochondrial DNA copy number and function in hepatocyte of non-alcoholic steatohepatitis in mice

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K16983
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 荒生 祥尚 新潟大学, 医歯学総合病院, 特任助教 (40870142)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: ミトコンドリアDNAコピー数 / マイトファジー / NAFL / NASH

Outline of Annual Research Achievements

マイトファジーレポーターマウス（OMP25-mCherry-GFPトランスジェニックマウス）の飼育を開始した。まずは通常食、メチオニンコリン欠乏食（MCD）、高脂肪食（HFD）を投与し、サンプルを回収した。マイトファジーレポーターマウスとC57B6Jマウスにおいて、特殊食餌投与によりモデルとして差がないかを肝組織で評価したが、脂肪や線維化の程度は、HFD、MCD各々でそれほど変化はなく、マイトファジーレポーターマウスでもMCDやHFDによる特殊食餌でもモデルとしては有効であることを確認した。マイトファジーレポーターマウスでは、心筋や骨格筋ではマイトファジーを示唆するmCherry単独の観察が比較的明瞭に観察されるが、肝臓においては自家蛍光の影響で、安定した観察が確立できていない状況である。クエンチング処理を行ったが、やはり自家蛍光は抑えられていない状況である。現在はQ-PCRによるマイトファジー関連遺伝子であるBNIP3など、またウエスタンブロッティングによりHFDやMCDでマイトファジーの発現に差があるかを蛍光観察以外の手法で評価中である。また、それと同時進行で、それぞれの群におけるミトコンドリアDNAコピー数の評価や、電子顕微鏡を用いてのミトコンドリアの形態評価（メガミトコンドリア有無など）も確認中である。今後はこれらの系が確立した後に、メチオニンコリン欠乏高脂肪食（CDAHFD）での解析も予定している。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

マイトファジーレポーターマウスを飼育したが、繁殖が悪く、解析に必要な頭数を得るのに時間がかかっている。また、肝臓における評価は自家蛍光の影響などもあり、安定した評価が困難であった。

Strategy for Future Research Activity

MCDやHFD投与されたマイトファジーレポーターマウスの肝臓のサンプルを用いて、マイトファジー関連遺伝子のQ-PCRや、ウエスタンブロッティングを行い、通常食とHFD、MCDでのマイトファジーの差があるか評価する。それと同時に、共焦点顕微鏡を用いた肝臓でのマイトファジーの解析を確立する。また、ミトコンドリアの機能評価としてATP assayや、フラックスアナライザーなどを用いて評価も行っていく。

Causes of Carryover

マイトファジーレポーターマウスの飼育が困難であり、サンプル確保に時間がかかったため。