膵臓がんに対する次世代型免疫療法開発にむけた腫瘍細胞に特異的な糖鎖構造の解析

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K17001
• Research Institution: Showa University
• Principal Investigator: 大熊 遼太朗 昭和大学, 医学部, 講師 (30833769)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: PIGR / レクチンアレイ / CAR-T

Outline of Annual Research Achievements

抗癌剤耐性や予後不良に関与する分子としてOLFM4・PIGRを同定し、CAR-T療法の標的抗原の候補として研究を行ってきた。しかしOLFM4・PIGRの発現解析では腫瘍細胞だけでなく一部の正常細胞にも発現することが判明し、強力な治療(CAR-T療法)を行う標的抗原としては正常細胞をも傷害してしまう可能性がある。我々はこれまでに膵臓癌患者と健常者サンプルを用いてOLFM4・PIGRにおける糖鎖発現解析を行った。12種類のレクチンで検討すると、PIGRではレクチン-Aについては正常細胞に比較して腫瘍細胞で強く染色されている症例が多く、正常細胞と腫瘍細胞との識別に有用と考えられ、PIGRについて検討を進めることとした。
今年度、我々はPIGRの抗体作製を実施した。抗体産生に使用する動物はマウスを使用した。マウスにPIGR抗原を注射し、脾臓から抗体産生するB細胞を抽出した。抗体を産生しているB細胞と不死化したがん細胞を人工的に融合させ、PIGR抗体遺伝子を維持しながら半永久的に生存できる融合細胞(ハイブリドーマ)を作製した。このハイブリドーマの中から、結合親和性や特異性に優れた有用なモノクローナル抗体を産生する細胞を選択している。
また、レクチンアレイを用いた網羅的解析も実施している。スライドガラス上に糖鎖と結合する能力をもつレクチンを多数配置させたマイクロアレイであり、98レクチンを解析した。ヒト乳癌細胞株MDA-MB-231においては、正常細胞と比較して乳癌細胞株において高発現となっているレクチンが同定されており、PIGRと組み合わせた検討で腫瘍細胞と正常細胞とを分別できる可能性があり検討を進めている。
CAR-Tの作成に関しては、Jurkut細胞(ヒト白血病T細胞株)や末梢血単核細胞(PBMC)を用いてウイルス感染やトランスフェクションによる遺伝子導入効率を確認した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

抗癌剤耐性や予後不良に関与する分子としてOLFM4・PIGRを同定し、CAR-T療法の標的抗原の候補として研究を行ってきたが、腫瘍細胞だけでなく一部の正常細胞にも発現することが判明し、強力な治療(CAR-T療法)を行う標的抗原としては正常細胞をも傷害してしまう可能性がある。我々はこれまでに膵臓癌患者と健常者サンプルを用いてOLFM4・PIGRにおける糖鎖発現解析を行い、PIGRではレクチン-Aについては正常細胞に比較して腫瘍細胞で強く染色される症例が多く、正常細胞と腫瘍細胞との識別に有用と考えられ、PIGRについて検討を進めることとした。
今年度、PIGRの抗体作製を実施した。マウスにPIGR抗原を注射し、脾臓から抗体産生するB細胞を抽出した。抗体を産生しているB細胞と不死化したがん細胞を人工的に融合させ、PIGR抗体遺伝子を維持しながら半永久的に生存できる融合細胞(ハイブリドーマ)を作製した。このハイブリドーマの中から、結合親和性や特異性に優れた有用なモノクローナル抗体を産生する細胞を選択している。
レクチンアレイを用いた網羅的解析も実施している。スライドガラス上に糖鎖と結合する能力をもつレクチンを多数配置させたマイクロアレイであり、98レクチンを解析した。ヒト乳癌細胞株MDA-MB-231においては、正常細胞と比較して乳癌細胞株において高発現となっているレクチンが同定されており、PIGRと組み合わせた検討で腫瘍細胞と正常細胞とを分ける可能性があり検討を進める。
CAR-Tの作成については、Jurkut細胞(ヒト白血病T細胞株)や末梢血単核細胞(PBMC)を用いてウイルス感染やトランスフェクションによる遺伝子導入効率を確認している。今後は糖鎖修飾を受けたPIGR分子を標的としたCAR-T療法の研究を中心に進めていく。

Strategy for Future Research Activity

CAR-T細胞に搭載することを検討しているPIGRに対する抗体作製を外部業者にも委託しながら進めていく方針である。また、上記PIGR抗体の情報をもとにPIGRと特異的に結合するCARを構築し、レンチウイルスベクターを用いて健常人末梢血又はJURKAT細胞に遺伝子導入してCAR-T細胞の樹立を進める。そして作製したCAR-T細胞内に、現在同定中のレクチン-Aを搭載させ、レクチンと抗体の両方のシグナルが入ったときのみONとなるCARシステムを構築する方針で、今後の研究推進方策を検討している。
進捗が順調に進めば、作製したLectin-CARを、PIGRの発現を認める固形がん細胞株と共培養して、細胞障害活性及びサイトカイン産生能を解析する。また我々が作製しPIGRを同定したPDXモデルを用いて抗腫瘍効果及び有害事象を検証していく方針である。

Causes of Carryover

試薬を購入した際、見積もっていた額より安価であったため残金が発生した。
次年度の交付額と合わせ、試薬や資材購入の際に有効に使用していきたい。