肝発癌におけるCCNDBP1とDNA損傷チェックポイント機構の関連性の解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K17043
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 横尾 健 新潟大学, 医歯学総合研究科, 特任准教授 (80750629)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: ccndbp1

Outline of Annual Research Achievements

まず、chk1、chk2、rosa26をターゲットとしたsgRNAとCas9タンパク(RNP)を培養細胞内へとトランスフェクションし、CRISPR/Cas9システムを利用して標的DNAの切断を試みた。この際にpuromycin耐性遺伝子とRFPの発現カセットをコードしたdonor DNAを同時に細胞内へ送達することで、 相同組み換え型修復(HDR)によるknock inを誘導し、puromycinならびにRFPを用いた遺伝子編集細胞の選別が可能となるようにあらかじめ設計した。初回のトランスフェクションでは、HDRの効率が低かったため、puromycinによる細胞選別が困難な状況であった。そこで、HDRと競合する非相同末端結合(NHEJ)反応を阻害するためSCR7ピラジンを培地へ加える方針とし、さらにsgRNAの設計についても再考した。新たに設計したsgRNAの切断効率を評価・確認した上で、改めて、RNPのトランスフェクションを行った。現在は、puromycinによるselectionを行っている最中であり、PCRとシークエンス解析による標的遺伝子の編集成否の確認を経たのちに、ccndbp1ならびにDNA損傷CP機構関連遺伝子(chk1、chk2、ATR、ATM、cdc25、p53、p21)の転写・発現解析をRT-PCR、免疫染色、ウェスタンブロッティングによって試みる予定としている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

遺伝子編集、特にHDRの効率が低かったため、プロトコールの修正が必要となったため、当初よりも計画がやや遅れている。

Strategy for Future Research Activity

遺伝子編集効率が低い可能性があることは計画立案時の想定にも含まれていたため、SCR7の利用やsgRNAの再設計により修正可能な遅れであると考えている。引き続き、遺伝子編集の成否の評価と、ccndbp1ならびにDNA損傷CP機構関連遺伝子(chk1、chk2、ATR、ATM、cdc25、p53、p21)の転写・発現解析を継続する予定である。