肝発癌におけるCCNDBP1とDNA損傷チェックポイント機構の関連性の解明

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K17043
• Research Institution: Niigata University
• Principal Investigator: 横尾 健 新潟大学, 医歯学総合研究科, 特任准教授 (80750629)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: ccndbp1 / chk1 / chk2

Outline of Annual Research Achievements

昨年度は、マウス肝細胞由来のcell lineであるAML12に対して、RNPをトランスフェクトすることでchk1とchk2を相同組換え修復(Puromycin耐性遺伝子を挿入)を利用してノックアウトし、Puromycinによるセレクションの後に解析することを試みたが、遺伝子改変効率が低く解析に難渋したため、当初の目標であった遺伝子改変細胞を免疫不全マウスに移植することは断念する方針とした。一方で、昨年度実績報告書作成に並行して、sgRNAの設計の見直し、トランスフェクション試薬や暴露時間の変更、SCR7添加、Puromycinの濃度設定などの実験条件の再検討を行っていたところ、遺伝子改変効率を改善することに成功した。その結果、コントロールとしてalbをターゲットとした場合には、Puromycin耐性コロニーを容易に確認することが可能となった。同コロニー由来の細胞からmRNAを抽出し、qPCRを行うとalbの転写が有意に低下していることも確認可能であった。ところが、chk1をターゲットとした場合は極端に生存細胞が少なく、Puromycin耐性コロニーの形成は認めなかった。同様にin vivo実験として、マウス肝に対してAAV8ベクターを用いてchk1ターゲットのsgRNAならびにcas9のcDNAを導入した場合にも、回収した肝サンプル内にKO後の細胞を検出することができなかった。十分な量の遺伝子改変細胞を採取することが不可能であったため、詳細な解析には至っていないが、ここまでの結果からはマウス肝細胞においてｃｈｋ1が細胞生存に必須の因子である可能性が示唆された。現在、chk1をターゲットとしたヒト肝癌由来のcell lineでの検証、ならびにchk2をターゲットとした検証を継続中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

前年度の結果を受けて、免疫不全マウスへの細胞移植を断念し、遺伝子改変細胞株ならびに遺伝子改変マウスを中心とした解析に計画を修正した。修正後の計画の中では、概ね予定通りに解析を進めているが1年の延長を加味して、やや遅れている、とした。

Strategy for Future Research Activity

マウス肝細胞でのchk1 KOの結果をもとに、ヒト肝癌由来のcell lineでの検証とchk2 KOの検証を行い、ccndbp1とDNA損傷チェックポイント(CP) 機構の肝発癌における関連性を解析していく予定である。

Causes of Carryover

当初の計画の変更が必要となったため、免疫不全マウスの購入とそのサンプル解析に充当予定であった支出がなくなり繰越金が生じた。変更した研究計画を遂行するために研究期間の延長申請を完了しており、追加1年間の解析費用（試薬代や外注委託費用）として繰越分を使用する予定である。