対向型塩基損傷に対するDNA修復の検証-炎症性発がんのメカニズムの探求-

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K17055
• Research Institution: Kawasaki Medical School
• Principal Investigator: 森脇 隆仁 川崎医科大学, 医学部, 助教 (60734100)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: DNA修復 / 炎症

Outline of Annual Research Achievements

本研究は細胞内における対向型DNA損傷を修復するタンパク質を同定し、対向型DNA損傷の修復メカニズムを明らかにするとともに、その炎症性発がんへの寄与を調べることである。申請者らは独自にヒト肝細胞でゲルシフトアッセイより対向型DNA損傷を認識するタンパク質の存在を確認していたが、さらなる詳細の解析のため、今回新たにHela－Kyoto細胞での実験系の確立を試みた。
HeLa-Kyoto細胞から細胞抽出液を調整し、申請者らが独自にデザインした対向型DNA損傷基質DNAを用いてゲルシフトアッセイおよびトラッピングアッセイを行った。その結果、両方のアッセイで対向型DNA損傷基質DNAを認識すると思われるタンパク質のシグナルが観察できた。このことから、HeLa-Kyoto細胞内には対向型DNA損傷を認識するタンパク質が存在することと同時に、それがDNA AP lyase活性を持つことが明らかとなった。
その後申請者らは、ビオチン標識した対向型DNA損傷基質DNAを用いて修復タンパク質のプルダウンを試みた。条件を変えながら複数回試行したが、特異的なタンパク質の濃縮は観察されなかった。原因として2点があげられ、1点はビオチンによるプルダウンでは非常にバックグラウンドが高かったことがあげられる。さらにもう一点、修復タンパク質に基質を切断する活性があるため、対向型DNA損傷基質DNAでは安定して結合タンパク質をプルダウンできなない点も考えられる。今後は修復タンパク質同定のため、ゲルのバンドシグナル付近を切り出し、タンパク質を抽出し、質量分析を行う予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

ビオチン標識を施した対向型DNA損傷基質を用いてプルダウンを試みたが、認識タンパク質の分解活性のためか、うまくいかなかった。今後はゲルシフトアッセイやトラッピングアッセイにおけるバンドをゲルから切り出し、質量分析を行う方法を試みる予定である。

Strategy for Future Research Activity

前述のとおり、ビオチン標識対向型DNA損傷基質を用いたプルダウンの実験系はうまく機能しなかった。今後はこれまで結果が得られている、ゲルシフトアッセイ、トラッピングアッセイにおけるバンドをゲルから切り出し、それをもとにさらなる解析を進めていく予定である。