ユビキチン・プロテアソーム系を標的とした新規胃癌治療の開発

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 20K17058
• Research Institution: Nagoya City University
• Principal Investigator: 尾関 貴紀 名古屋市立大学, 医薬学総合研究院(医学), 助教 (10865702)
• Project Period (FY): 2020-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 胃癌 / CUL3 / BTB蛋白

Outline of Annual Research Achievements

本年度は、①胃癌におけるBTB蛋白の細胞レベルでの機能解析および②胃癌におけるBTBPの標的基質の検索を中心に研究をすすめた。胃癌細胞株は、SNU-1、NCI-N87、MKN7の3種類を使用した。これまでにCUL3と結合し、これらの胃癌細胞株での発現を確認しているKLHL2, KLHL3,KLHL4, KLHL5, KLHL6,KLHL9, KLHL12, KLHL19, KLHL26, KLHL27, KLHL36, KLHL37, KLHL39のsiRNAを作成した。各siRNAの遺伝子発現抑制効果をqRT-PCRで検討したところ、70~90%とおおむね良好であった。おのおのの胃癌細胞株のKLHL siRNAによる細胞増殖抑制効果についてWST assayを用いて検討したところ、複数のKLHL siRNAで有意な増殖抑制効果が示された。具体的には、SNU-1においては、KLHL5, KLHL26, KLHL36のsiRNAで、NCI-N87およびMKN7ではKLHL26のsiRNAで有意に細胞増殖が抑制されていた。3つの細胞株に共通して有意に細胞増殖を誘導したKLHL26に対象を絞りさらに検討をすすめた。なお、細胞増殖を増強するKLHL siRNAも認めたが、3つの細胞に共通して増殖を誘導するものはなく、また、増殖効果も有意差があるものの僅かな変化で、これらのKLHLのさらなる検討は見送った。KLHL26 siRNAに耐性を有するKLHL26発現ベクターを作成し、胃癌細胞株に遺伝子導入を行った。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

kockdown効率の良好なKLHL siRNAの作成に時間を要し、siRNAを用いた実験の遂行が遅れてしまった。

Strategy for Future Research Activity

候補BTBPのshRNAを作製する。Tet-onシステムを有するpTRIPZ lentiviral（Open biosystem）へのBTBP shRNAのパッケージングを行う。このウイルスを胃癌細胞に感染させ、ドキシサイクリン存在下にBTBP shRNAが誘導されBTBPがknockdownされる細胞システムを構築し、マウスを用いた腫瘍モデルの実験の準備をすすめる。

Causes of Carryover

siRNAの作成に時間を要し、また、新型コロナウイルス感染の影響で、一時的に実験に制限が生じたため。